Разработка мобильной митохондриальной лаборатории позволяет физиологам перенести свою работу в поле, и в результате они могут оценить увлекательное разнообразие энергетических проблем, которые демонстрируют животные. Содержание в неволе является стрессом для многих животных, поэтому с помощью мобильной лаборатории мы теперь можем доставить лабораторию к животным, а не возвращать их обратно в лабораторию. Благодаря возможности изолировать и измерять митохондриальное дыхание в полевых условиях, методы, которые в основном использовались биомедициной, теперь могут быть использованы в экологическом и эволюционном контексте.
Начните с парковки мобильной лаборатории на ровной площадке, затем включите генератор и выровняйте транспортное средство. Выдвиньте ползун перед установкой оборудования. Приступайте к настройке и калибровке дыхательных камер митохондрий до желаемой температуры экспериментов и текущего барометрического давления в соответствии с инструкциями производителя.
Используйте отрезанный наконечник пипетки объемом пять миллилитров, чтобы переложить измельченную ткань в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и гомогенизировать ткань лезвием на мощности 50% в течение пяти секунд. Чтобы переварить ткань, добавьте пять миллиграммов протеазы на грамм влажной мышцы в течение семи минут, перемешивая раствор каждые 30 секунд. Завершите реакцию, добавив равный объем буфера изоляции, содержащего BSA.
Затем центрифугируют гомогенат при 500 г в течение 10 минут, затем переносят надосадочную жидкость с помощью отрезанного пятимиллилитрового наконечника пипетки через двухслойную марлю в чистую 50-миллилитровую центрифужную пробирку, затем центрифугируют отфильтрованную надосадочную жидкость при 3 500 г в течение 10 минут, чтобы осадок превратилась в коричневую митохондриальную гранулу. После удаления надосадочной жидкости добавьте тот же объем изоляционного буфера, содержащего БСА, в центрифужную пробирку и повторно суспендируйте митохондриальную гранулу с помощью гибкого скребка, осторожно отталкивая митохондриальную гранулу от стенок центрифужной пробирки, затем центрифугируйте пробирку при 3 500 G в течение 10 минут. Повторно суспендируйте гранулу в изоляционном буфере без BSA, чтобы повторить этап центрифугирования, как описано выше.
После второго центрифугирования ресуспендируйте митохондриальную гранулу в буфере для ресуспендирования с помощью чистого гибкого скребка и перенесите ресуспендированные митохондрии в гомогенизатор Dounce с отрезанным наконечником пипетки объемом один миллилитр. С помощью гомогенизатора тщательно гомогенизируйте митохондриальную суспензию за четыре-пять проходов. Используйте свежесрезанный наконечник дозатора объемом один миллилитр для переноса гомогенизированной митохондриальной суспензии в пробирку микроцентрифуги объемом два миллилитра с этикеткой.
Для измерения митохондриального дыхания сложных субстратов добавьте 945 микролитров дыхательного буфера в митохондриальную дыхательную камеру. Убедитесь, что мешалка вращается, когда буферная температура поддерживается на уровне 37 градусов по Цельсию. Запечатайте камеру сверху, а затем начните запись сбора данных.
После того, как концентрация кислорода стабилизируется, добавьте в камеру 20 микролитров митохондриальной суспензии и установите крышку. В программном обеспечении обозначим, что митохондрии были добавлены в камеру. Добавьте по 10 микролитров одного молярного глутамата, 200 миллимолярного малата и 200 миллимолярного пирувата в камеру с помощью отдельных шприцев и подождите, пока сигнал стабилизируется, прежде чем указывать добавленные субстраты в программном обеспечении.
С помощью отдельного шприца добавьте в камеру пять микролитров аденозиндифосфата, или АДФ. Обозначим добавленный АДФ в программном обеспечении и наблюдаем за быстрым потреблением кислорода в третьем состоянии. После третьего состояния дыхание и потребление кислорода митохондриями замедлились на четыре минуты, чтобы указать на дыхание четвертого состояния, прервать запись и сохранить файл данных.
Для двух сложных субстратов повторите процедуру, добавив в камеру 963 микролитра дыхательного буфера. После добавления 20 микролитров митохондриальной суспензии последовательно добавляют в камеру два микролитра по четыре микрограмма на микролитр ротенона и 10 микролитров 500 миллимолярного сукцината с помощью отдельных шприцев. Когда сигнал стабилизируется, обозначьте добавление подложки в программном обеспечении.
При добавлении пяти микролитров АДФ наблюдайте за быстрым потреблением кислорода в третьем состоянии и указывайте добавление АДФ в программном обеспечении. После третьего состояния дыхание и потребление кислорода митохондриями замедлились на четыре минуты, чтобы указать на дыхание четвертого состояния, прервать запись и сохранить файл данных. Репрезентативные результаты указывают на исходные данные о митохондриальном дыхании.
Крутой склон третьей ступени в сложных субстратах представляет собой высокую максимальную частоту дыхания. Успешное выделение митохондрий из скелетной мускулатуры задних конечностей наблюдалось по резкому повороту и стабилизации нового наклона четвертого состояния. Аналогичная картина может наблюдаться и для сложного двухканального митохондриального дыхания.
Плохое функционирование митохондрий приводило к тому, что митохондрии связывались для сложного митохондриального дыхания. Тем не менее, другой типичный пример плохого функционирования митохондрий показал несвязанное двухмитохондриальное дыхание с плоской линией после добавления АДФ, и отсутствие поворота к получению данных о состоянии 4. Численные значения третьего состояния, четвертого состояния и коэффициента контроля дыхания (RCR) как для первого, так и для второго комплекса были определены по данным измерений дыхания Во время сбора дополнительные ткани могут быть мгновенно заморожены, чтобы использовать их в будущем для измерения плотности митохондрий или окислительного повреждения.
Кроме того, после процедуры изолированные митохондрии также могут быть заморожены для измерения активности электронно-транспортных и цепных комплексов. Способность изолировать и измерять митохондриальное дыхание в полевых условиях проложит путь к лучшему пониманию роли митохондрий в эволюции сложной жизни.
