El desarrollo de un laboratorio mitocondrial móvil permite a los fisiólogos llevar su trabajo al campo y, como resultado, pueden evaluar una fascinante diversidad de desafíos energéticos que muestran los animales. El cautiverio es estresante para muchos animales, por lo que con un laboratorio móvil, ahora podemos llevar el laboratorio a los animales en lugar de llevarlos de regreso al laboratorio. Con la capacidad de aislar y medir la respiración mitocondrial en el campo, las técnicas que fueron utilizadas principalmente por la biomedicina ahora se pueden usar en contextos ecológicos y evolutivos.
Comience estacionando el laboratorio móvil en un terreno plano, luego encienda el generador y nivele el vehículo. Extienda el tobogán antes de instalar el equipo. Proceda a configurar y calibrar las cámaras de respiración mitocondrial a la temperatura deseada de los experimentos y a la presión barométrica actual según las instrucciones del fabricante.
Utilice una punta de pipeta cortada de cinco mililitros para transferir el tejido picado a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y homogeneice el tejido con una cuchilla al 50% de potencia durante cinco segundos. Para digerir el tejido, agregue cinco miligramos de proteasa por gramo de músculo húmedo durante siete minutos, mezclando la solución cada 30 segundos. Termine la reacción agregando un volumen igual del tampón de aislamiento que contiene BSA.
A continuación, centrifugue el homogeneizado a 500 G durante 10 minutos, luego transfiera el sobrenadante con una punta de pipeta cortada de cinco mililitros a través de la gasa de doble capa a un tubo de centrífuga limpio de 50 mililitros, luego centrifugue el sobrenadante filtrado a 3, 500 G durante 10 minutos para precipitar un gránulo mitocondrial marrón. Después de desechar el sobrenadante, agregue el mismo volumen del tampón de aislamiento que contiene BSA al tubo de centrífuga y vuelva a suspender el gránulo mitocondrial con un raspador flexible trabajando suavemente el gránulo mitocondrial fuera de las paredes del tubo de centrífuga, luego centrifugue el tubo a 3, 500 G durante 10 minutos. Vuelva a suspender el gránulo en el tampón de aislamiento sin BSA para repetir el paso de centrifugación como se describió anteriormente.
Después de la segunda centrifugación, vuelva a suspender el gránulo mitocondrial en el tampón de resuspensión con un raspador limpio y flexible, y transfiera las mitocondrias resuspendidas a un homogeneizador Dounce con una punta de pipeta cortada de un mililitro. Con el homogeneizador, homogeneice cuidadosamente la suspensión mitocondrial con cuatro o cinco pasadas. Utilice una punta de pipeta de un mililitro recién cortada para transferir la suspensión mitocondrial homogeneizada en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros marcado.
Para las mediciones de la respiración mitocondrial de los sustratos complejos, agregue 945 microlitros del tampón de respiración a la cámara de respiración mitocondrial. Asegúrese de que el agitador esté girando cuando la temperatura del tampón se mantenga a 37 grados centígrados. Selle la cámara con la parte superior y luego comience a registrar la recopilación de datos.
Una vez que la concentración de oxígeno se haya estabilizado, agregue 20 microlitros de la suspensión mitocondrial a la cámara y coloque la tapa. En el software, denota que las mitocondrias se agregaron a la cámara. Agregue 10 microlitros de glutamato molar, 200 milimolares de malato y 200 milimolares de piruvato a la cámara con las jeringas individuales, y espere hasta que la señal se estabilice antes de indicar los sustratos agregados en el software.
Use una jeringa separada para agregar cinco microlitros de difosfato de adenosina, o ADP, a la cámara. Denote el ADP agregado en el software y observe el rápido consumo de oxígeno del estado tres. Después de que la respiración en el estado tres y el consumo de oxígeno mitocondrial se hayan ralentizado durante cuatro minutos para indicar la respiración en el estado cuatro, finalice la grabación y guarde el archivo de datos.
Para los dos sustratos complejos, repita el procedimiento agregando 963 microlitros del tampón de respiración a la cámara. Después de agregar 20 microlitros de la suspensión mitocondrial, agregue secuencialmente dos microlitros de cuatro microgramos por microlitro de rotenona y 10 microlitros de succinato de 500 milimolares a la cámara usando las jeringas separadas. Cuando la señal se estabilice, denote la adición de sustrato en el software.
Con la adición de cinco microlitros de ADP, observe el rápido consumo de oxígeno del estado tres e indique la adición de ADP en el software. Después de que la respiración en el estado tres y el consumo de oxígeno mitocondrial se hayan ralentizado durante cuatro minutos para indicar la respiración en el estado cuatro, finalice la grabación y guarde el archivo de datos. Los resultados representativos indican los datos brutos de la respiración mitocondrial.
La pendiente pronunciada del paso tres en los sustratos complejos uno representa la alta tasa de respiración máxima. El aislamiento exitoso de las mitocondrias del músculo esquelético de las extremidades posteriores se observó por el giro brusco y la estabilización de una nueva pendiente del estado cuatro. Un patrón similar podría observarse para la respiración mitocondrial compleja impulsada por dos unidades.
El mal funcionamiento de las mitocondrias dio lugar al acoplamiento de las mitocondrias para la respiración mitocondrial compleja impulsada por uno. Sin embargo, otro ejemplo típico de mal funcionamiento de las mitocondrias mostró la respiración mitocondrial desacoplada del complejo dos con una línea plana después de la adición de ADP, y sin giro para producir los datos del estado cuatro. Los valores numéricos del estado tres, el estado cuatro y la relación de control respiratorio, o RCR, tanto para el complejo uno como para el complejo dos se determinaron a partir de los datos de medición de la respiración. Durante la recolección, se pueden congelar rápidamente tejidos adicionales para usarlos en el futuro para medir la densidad mitocondrial o el daño oxidativo.
Además, después del procedimiento, las mitocondrias aisladas también se pueden congelar para medir las actividades del transporte de electrones y los complejos de cadenas. La capacidad de aislar y medir la respiración mitocondrial en el campo allanará el camino para mejorar nuestra comprensión del papel de las mitocondrias en la evolución de la vida compleja.
