이동식 미토콘드리아 실험실의 개발로 생리학자들은 자신의 연구를 현장으로 가져갈 수 있으며, 그 결과 동물이 나타내는 다양한 에너지 문제를 평가할 수 있습니다. 포획은 많은 동물에게 스트레스를 주기 때문에 이동식 실험실을 사용하면 동물을 실험실로 다시 데려오는 대신 실험실을 동물에게 맡길 수 있습니다. 현장에서 미토콘드리아 호흡을 분리하고 측정할 수 있는 능력을 통해 생물 의학에서 주로 사용되던 기술을 이제 생태학적 및 진화론적 맥락에서 사용할 수 있습니다.
이동식 실험실을 평지에 주차한 다음 발전기를 켜고 차량의 수평을 맞추십시오. 장비를 설치하기 전에 슬라이드를 확장하십시오. 제조업체의 지침에 따라 미토콘드리아 호흡 챔버를 원하는 실험 온도와 현재 기압으로 설정하고 보정합니다.
절단된 5밀리리터 피펫 팁을 사용하여 다진 조직을 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 5초 동안 50% 전력으로 칼날로 조직을 균질화합니다. 조직을 소화시키기 위해 젖은 근육 1g당 5mg의 프로테아제를 7분 동안 첨가하고 30초마다 용액을 혼합합니다. BSA를 함유하는 동일한 부피의 분리 완충액을 첨가하여 반응을 종료합니다.
다음으로, 균질액을 500 G에서 10 분 동안 원심 분리 한 다음 절단 된 5 밀리리터 피펫 팁을 사용하여 상층액을 이중층 무명천을 통해 깨끗한 50 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮긴 다음 여과 된 상층액을 3, 500 G에서 10 분 동안 원심 분리하여 갈색 미토콘드리아 펠릿을 침전시킵니다. 상층액을 버린 후, BSA를 포함하는 격리 완충액의 동일한 부피를 원심 분리기 튜브에 추가하고, 원심 분리기 튜브의 벽에서 미토콘드리아 펠릿을 부드럽게 작동시켜 유연한 스크레이퍼로 미토콘드리아 펠릿을 재현탁 한 다음 3, 500 G에서 튜브를 10 분 동안 원심 분리합니다. BSA 없이 분리 완충액에 펠릿을 재현탁하여 앞에서 설명한 대로 원심분리 단계를 반복합니다.
두 번째 원심분리 후 깨끗하고 유연한 스크레이퍼를 사용하여 재현탁 완충액에 미토콘드리아 펠릿을 재현탁시키고 재현탁된 미토콘드리아를 절단된 1밀리리터 피펫 팁이 있는 Dounce 균질화기로 옮깁니다. 균질화기를 사용하여 미토콘드리아 현탁액을 4-5회 통과하여 조심스럽게 균질화합니다. 새로 절단된 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 균질화된 미토콘드리아 현탁액을 라벨이 부착된 2밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 이송합니다.
복합체 기질의 미토콘드리아 호흡 측정을 위해 미토콘드리아 호흡 챔버에 945마이크로리터의 호흡 완충액을 추가합니다. 버퍼 온도가 섭씨 37도로 유지될 때 교반기가 회전하는지 확인하십시오. 챔버를 상단으로 밀봉한 다음 데이터 수집 기록을 시작합니다.
산소 농도가 안정화되면 20 마이크로 리터의 미토콘드리아 현탁액을 챔버에 넣고 뚜껑을 놓습니다. 소프트웨어에서 미토콘드리아가 챔버에 추가되었음을 나타냅니다. 글루타메이트 1몰, 말레이트 200밀리몰, 피루브산 200밀리몰을 각각 10마이크로리터씩 개별 주사기로 챔버에 추가하고 신호가 안정화될 때까지 기다렸다가 소프트웨어에 추가된 기판을 표시합니다.
별도의 주사기를 사용하여 5마이크로리터의 아데노신 이인산염(ADP)을 챔버에 추가합니다. 소프트웨어에 추가된 ADP를 나타내고 상태 3의 빠른 산소 소비를 관찰합니다. 상태 3 호흡 및 미토콘드리아 산소 소비가 4분 동안 느려진 후 상태 4 호흡을 나타내기 위해 기록을 종료하고 데이터 파일을 저장합니다.
복잡한 두 기질의 경우 챔버에 963 마이크로리터의 호흡 완충액을 추가하여 절차를 반복합니다. 미토콘드리아 현탁액 20 마이크로리터를 첨가한 후, 별도의 주사기를 사용하여 로테논 마이크로리터당 4마이크로그램의 2 마이크로리터와 500 밀리몰 숙시네이트 10 마이크로리터를 챔버에 순차적으로 첨가한다. 신호가 안정화되면 소프트웨어에서 기판 추가를 나타냅니다.
5마이크로리터의 ADP를 추가하여 상태 3의 빠른 산소 소비를 관찰하고 소프트웨어에 ADP가 추가되었음을 나타냅니다. 상태 3 호흡 및 미토콘드리아 산소 소비가 4분 동안 느려진 후 상태 4 호흡을 나타내기 위해 기록을 종료하고 데이터 파일을 저장합니다. 대표적인 결과는 원시 미토콘드리아 호흡 데이터를 나타냅니다.
복합 1 기질에서 3단계의 가파른 경사는 높은 최대 호흡수를 나타냅니다. 뒷다리 골격근에서 미토콘드리아를 성공적으로 분리한 것은 급격한 회전과 상태 4의 새로운 기울기의 안정화에 의해 관찰되었습니다. 복잡한 2 구동 미토콘드리아 호흡에 대해서도 유사한 패턴이 관찰될 수 있습니다.
미토콘드리아의 열악한 기능은 복잡한 것 몬 미토콘드리아 호흡을 위한 미토콘드리아의 결합을 귀착시켰다. 그러나 미토콘드리아 기능 저하의 또 다른 전형적인 예는 ADP를 첨가한 후 평평한 선으로 결합되지 않은 복합체 2 미토콘드리아 호흡을 보여주었고 상태 4 데이터를 생성하기 위한 회전이 없었습니다. 복합 1 및 복합 2 모두에 대한 상태 3, 상태 4 및 호흡 제어 비율(RCR)의 수치는 호흡 측정 데이터에서 결정되었습니다 수집 중에 추가 조직은 향후 미토콘드리아 밀도 또는 산화 손상을 측정하는 데 사용하기 위해 급속 동결될 수 있습니다.
또한 시술 후 분리된 미토콘드리아를 동결하여 전자 수송 및 사슬 복합체의 활성을 측정할 수도 있습니다. 현장에서 미토콘드리아 호흡을 분리하고 측정할 수 있는 능력은 복잡한 생명체의 진화에서 미토콘드리아의 역할에 대한 이해를 높일 수 있는 길을 열어줄 것입니다.
