O desenvolvimento de um laboratório mitocondrial móvel permite que os fisiologistas levem seu trabalho para o campo e, como resultado, eles podem avaliar uma fascinante diversidade de desafios energéticos que os animais apresentam. O cativeiro é estressante para muitos animais, então com um laboratório móvel, agora podemos levar o laboratório para os animais em vez de trazê-los de volta para o laboratório. Com a capacidade de isolar e medir a respiração mitocondrial no campo, técnicas que eram usadas principalmente pela biomedicina agora podem ser usadas em contexto ecológico e evolutivo.
Comece estacionando o laboratório móvel em terreno plano, depois ligue o gerador e nivele o veículo. Estenda o slide antes de configurar o equipamento. Proceder à montagem e calibração das câmaras de respiração mitocondrial à temperatura desejada dos experimentos e à pressão barométrica atual de acordo com as instruções do fabricante.
Use uma ponta de pipeta cortada de cinco mililitros para transferir o tecido picado para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e homogeneize o tecido com uma lâmina a 50% de potência por cinco segundos. Para digerir o tecido, adicione cinco miligramas de protease por grama do músculo molhado por sete minutos, misturando a solução a cada 30 segundos. Termine a reação adicionando um volume igual do buffer de isolamento que contém BSA.
Em seguida, centrifugar o homogeneizado a 500 G por 10 minutos, em seguida, transferir o sobrenadante usando uma ponta de pipeta cortada de cinco mililitros através do pano de queijo de camada dupla em um tubo de centrífuga limpo de 50 mililitros e, em seguida, centrifugar o sobrenadante filtrado a 3.500 G por 10 minutos para precipitar uma pastilha mitocondrial marrom. Depois de descartar o sobrenadante, adicione o mesmo volume do tampão de isolamento contendo BSA ao tubo da centrífuga e ressuspenda o pellet mitocondrial com um raspador flexível, trabalhando suavemente o pellet mitocondrial fora das paredes do tubo da centrífuga e, em seguida, centrifugar o tubo a 3.500 G por 10 minutos. Ressuspenda o pellet no tampão de isolamento sem BSA para repetir a etapa de centrifugação conforme descrito anteriormente.
Após a segunda centrifugação, ressuspenda o pellet mitocondrial no tampão de ressuspensão com um raspador limpo e flexível e transfira a mitocôndria ressuspensa para um homogeneizador Dounce com uma ponta de pipeta cortada de um mililitro. Com o homogeneizador, homogeneizar cuidadosamente a suspensão mitocondrial com quatro a cinco passadas. Use uma ponta de pipeta de um mililitro cortada fresca para transferir a suspensão mitocondrial homogeneizada em um tubo de microcentrífuga marcado de dois mililitros.
Para as medidas da respiração mitocondrial dos substratos do complexo um, adicione 945 microlitros do tampão respiratório à câmara de respiração mitocondrial. Certifique-se de que o agitador está girando quando a temperatura do tampão for mantida em 37 graus Celsius. Sele a câmara com a parte superior e, em seguida, comece a gravar a coleta de dados.
Depois que a concentração de oxigênio estiver estabilizada, adicione 20 microlitros da suspensão mitocondrial à câmara e coloque a tampa. No software, denotam que as mitocôndrias foram adicionadas à câmara. Adicionar 10 microlitros cada de glutamato molar, malato de 200 milimolares e piruvato de 200 milimolares à câmara com as seringas individuais e aguardar até que o sinal se estabilize antes de indicar os substratos adicionados no software.
Use uma seringa separada para adicionar cinco microlitros de difosfato de adenosina, ou ADP, à câmara. Denote o ADP adicionado no software e observe o rápido consumo de oxigênio do estado três. Após o estado três, a respiração e o consumo de oxigênio mitocondrial diminuíram por quatro minutos para indicar o estado quatro de respiração, encerre o registro e salve o arquivo de dados.
Para os dois substratos complexos, repita o procedimento adicionando 963 microlitros do tampão respiratório à câmara. Depois de adicionar 20 microlitros da suspensão mitocondrial, adicionar sequencialmente dois microlitros de quatro microgramas por microlitro de rotenona e 10 microlitros de succinato de 500 milimolares à câmara usando as seringas separadas. Quando o sinal se estabilizar, denote a adição de substrato no software.
Com a adição de cinco microlitros de ADP, observe o rápido consumo de oxigênio do estado três e indique a adição de ADP no software. Após o estado três, a respiração e o consumo de oxigênio mitocondrial diminuíram por quatro minutos para indicar o estado quatro de respiração, encerre o registro e salve o arquivo de dados. Os resultados representativos indicam os dados brutos de respiração mitocondrial.
A inclinação acentuada do terceiro passo nos substratos do complexo um representa a alta taxa respiratória máxima. O isolamento bem sucedido da mitocôndria do músculo esquelético dos membros posteriores foi observado pelo giro brusco e pela estabilização de uma nova inclinação do estado quatro. Um padrão semelhante pôde ser observado para a respiração mitocondrial complexa conduzida por dois fatores.
O mau funcionamento das mitocôndrias resultou no acoplamento das mitocôndrias à complexa respiração mitocondrial. No entanto, outro exemplo típico de mau funcionamento mitocondrial mostrou o complexo desacoplado duas respiração mitocondrial com uma linha plana após a adição de ADP, e nenhuma volta para produzir o estado quatro dados. Os valores numéricos do estado três, do estado quatro e da razão de controle respiratório, ou RCR, tanto para o complexo um quanto para o complexo dois, foram determinados a partir dos dados de medição da respiração Durante a coleta, tecidos adicionais podem ser congelados para usá-los no futuro para medir a densidade mitocondrial ou dano oxidativo.
Além disso, após o procedimento, mitocôndrias isoladas também podem ser congeladas para medir as atividades de transporte de elétrons e complexos de cadeia. A capacidade de isolar e medir a respiração mitocondrial no campo abrirá o caminho para melhorar nossa compreensão do papel das mitocôndrias na evolução da vida complexa.
