Mobil bir mitokondriyal laboratuvarın geliştirilmesi, fizyologların çalışmalarını sahaya taşımalarına olanak tanır ve sonuç olarak, hayvanların sergilediği büyüleyici çeşitlilikteki enerjik zorlukları değerlendirebilirler. Esaret birçok hayvan için streslidir, bu nedenle mobil bir laboratuvarla artık hayvanları laboratuvara geri getirmek yerine laboratuvarı hayvanlara götürebiliriz. Sahada mitokondriyal solunumu izole etme ve ölçme yeteneği ile, öncelikle biyotıp tarafından kullanılan teknikler artık ekolojik ve evrimsel bağlamda kullanılabilir.
Mobil laboratuvarı düz bir zemine park ederek başlayın, ardından jeneratörü çalıştırın ve aracı düzleştirin. Ekipmanı kurmadan önce sürgüyü uzatın. Mitokondriyal solunum odalarını, üreticinin talimatlarına göre istenen deney sıcaklığına ve mevcut barometrik basınca göre kurmaya ve kalibre etmeye devam edin.
Kıyılmış dokuyu 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için beş mililitrelik bir pipet ucu kullanın ve dokuyu beş saniye boyunca% 50 güçte bir bıçakla homojenize edin. Dokuyu sindirmek için, yedi dakika boyunca ıslak kasın gramı başına beş miligram proteaz ekleyin ve çözeltiyi her 30 saniyede bir karıştırın. BSA içeren eşit hacimde izolasyon tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın.
Daha sonra, homojenatı 500 G'de 10 dakika santrifüjleyin, daha sonra süpernatanı kesilmiş beş mililitrelik bir pipet ucu kullanarak çift katmanlı tülbentten temiz bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın, ardından filtrelenmiş süpernatanı 3.500 G'de 10 dakika santrifüjleyin kahverengi bir mitokondriyal peleti çökeltmek için. Süpernatanı attıktan sonra, santrifüj tüpüne BSA içeren aynı hacimde izolasyon tamponu ekleyin ve mitokondriyal peleti santrifüj tüpünün duvarlarından nazikçe çalıştırarak mitokondriyal peleti esnek bir kazıyıcı ile yeniden süspanse edin, ardından tüpü 3, 500 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme adımını daha önce açıklandığı gibi tekrarlamak için peleti BSA olmadan izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin.
İkinci santrifüjlemeden sonra, mitokondriyal peleti temiz, esnek bir kazıyıcı ile yeniden süspansiyon tamponunda yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilmiş mitokondriyi kesilmiş bir mililitre pipet ucuna sahip bir Dounce homojenizatöre aktarın. Homojenizatör ile mitokondriyal süspansiyonu dört ila beş geçişle dikkatlice homojenize edin. Homojenize mitokondriyal süspansiyonu etiketli iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için yeni kesilmiş bir mililitrelik pipet ucu kullanın.
Kompleks bir substratın mitokondriyal solunum ölçümleri için, mitokondriyal solunum odasına 945 mikrolitre solunum tamponu ekleyin. Tampon sıcaklığı 37 santigrat derecede tutulduğunda karıştırıcının döndüğünden emin olun. Hazneyi üst kısmıyla kapatın ve ardından veri toplamayı kaydetmeye başlayın.
Oksijen konsantrasyonu stabilize olduktan sonra, hazneye 20 mikrolitre mitokondriyal süspansiyon ekleyin ve kapağı yerleştirin. Yazılımda, mitokondrinin odaya eklendiğini belirtin. Tek tek şırıngalarla hazneye her biri bir molar glutamat, 200 milimolar malat ve 200 milimolar piruvattan 10 mikrolitre ekleyin ve yazılımda eklenen substratları belirtmeden önce sinyalin stabilize olmasını bekleyin.
Hazneye beş mikrolitre adenozin difosfat veya ADP eklemek için ayrı bir şırınga kullanın. Yazılımda eklenen ADP'yi belirtin ve üçüncü durumun hızlı oksijen tüketimini gözlemleyin. Üçüncü durum solunumu ve mitokondriyal oksijen tüketimi, dördüncü durum solunumunu belirtmek için dört dakika boyunca yavaşladıktan sonra, kaydı sonlandırın ve veri dosyasını kaydedin.
Karmaşık iki substrat için, odaya 963 mikrolitre solunum tamponu ekleyerek prosedürü tekrarlayın. 20 mikrolitre mitokondriyal süspansiyon ekledikten sonra, ayrı şırıngaları kullanarak odaya sırayla mikrolitre rotenon başına iki mikrolitre dört mikrogram ve 10 mikrolitre 500 milimolar süksinat ekleyin. Sinyal stabilize olduğunda, yazılımdaki alt tabaka ilavesini belirtin.
Beş mikrolitre ADP ilavesiyle, üçüncü durumun hızlı oksijen tüketimini gözlemleyin ve yazılımda ADP ilavesini belirtin. Üçüncü durum solunumu ve mitokondriyal oksijen tüketimi, dördüncü durum solunumunu belirtmek için dört dakika boyunca yavaşladıktan sonra, kaydı sonlandırın ve veri dosyasını kaydedin. Temsili sonuçlar ham mitokondriyal solunum verilerini gösterir.
Karmaşık bir alt tabakadaki üçüncü adımın dik eğimi, yüksek maksimum solunum hızını temsil eder. Mitokondrinin arka bacak iskelet kasından başarılı bir şekilde izole edilmesi, keskin dönüş ve dördüncü durumun yeni bir eğiminin stabilizasyonu ile gözlendi. Benzer bir model, karmaşık iki tahrikli mitokondriyal solunum için de gözlemlenebilir.
Mitokondrinin zayıf işleyişi, mitokondrinin karmaşık tahrikli mitokondriyal solunum için bağlanmasına neden oldu. Bununla birlikte, zayıf mitokondri işleyişinin bir başka tipik örneği, ADP'nin eklenmesinden sonra düz bir çizgi ile bağlanmamış kompleks iki mitokondriyal solunumu gösterdi ve durum dört verisini üretmek için dönüş yapmadı. Hem kompleks bir hem de kompleks iki için durum üç, durum dört ve solunum kontrol oranının veya RCR'nin sayısal değerleri, solunum ölçüm verilerinden belirlendi Toplama sırasında, gelecekte mitokondriyal yoğunluğu veya oksidatif hasarı ölçmek için kullanılmak üzere ek dokular dondurulabilir.
Ek olarak, işlemden sonra, elektron taşıma ve zincir komplekslerinin aktivitelerini ölçmek için izole edilmiş mitokondri de dondurulabilir. Sahada mitokondriyal solunumu izole etme ve ölçme kapasitesi, karmaşık yaşamın evriminde mitokondrinin rolüne ilişkin anlayışımızı geliştirmenin yolunu açacaktır.
