Die Entwicklung eines mobilen Mitochondrienlabors ermöglicht es Physiologen, ihre Arbeit in die Praxis zu tragen und so eine faszinierende Vielfalt an energetischen Herausforderungen zu bewerten, die Tiere aufweisen. Die Gefangenschaft ist für viele Tiere stressig, daher können wir mit einem mobilen Labor jetzt das Labor zu den Tieren bringen, anstatt die Tiere zurück ins Labor zu bringen. Mit der Fähigkeit, die mitochondriale Atmung im Feld zu isolieren und zu messen, können Techniken, die vor allem in der Biomedizin eingesetzt wurden, nun im ökologischen und evolutionären Kontext eingesetzt werden.
Beginnen Sie damit, das mobile Labor auf ebenem Boden zu parken, schalten Sie dann den Generator ein und richten Sie das Fahrzeug aus. Fahren Sie die Schiene aus, bevor Sie das Gerät aufstellen. Fahren Sie mit dem Einrichten und Kalibrieren der mitochondrialen Atmungskammern auf die gewünschte Temperatur der Experimente und den aktuellen Luftdruck gemäß den Anweisungen des Herstellers fort.
Verwenden Sie eine abgeschnittene Fünf-Milliliter-Pipettenspitze, um das zerkleinerte Gewebe in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu übertragen, und homogenisieren Sie das Gewebe mit einer Klinge bei 50 % Leistung fünf Sekunden lang. Um das Gewebe zu verdauen, fügen Sie sieben Minuten lang fünf Milligramm Protease pro Gramm des feuchten Muskels hinzu und mischen Sie die Lösung alle 30 Sekunden. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie ein gleiches Volumen des BSA-haltigen Isolationspuffers hinzufügen.
Als nächstes zentrifugiert man das Homogenat 10 Minuten lang bei 500 g, dann überträgt man den Überstand mit einer abgeschnittenen Fünf-Milliliter-Pipettenspitze durch das doppellagige Mulltuch in ein sauberes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, dann zentrifugiert man den filtrierten Überstand bei 3.500 G 10 Minuten lang, um ein braunes mitochondriales Pellet auszufällen. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, geben Sie das gleiche Volumen des BSA-haltigen Isolationspuffers in das Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet mit einem flexiblen Schaber, indem Sie das mitochondriale Pellet vorsichtig von den Wänden des Zentrifugenröhrchens abarbeiten, und zentrifugieren Sie dann das Röhrchen bei 3.500 G für 10 Minuten. Resuspendieren Sie das Pellet ohne BSA im Isolationspuffer, um den Zentrifugationsschritt wie zuvor beschrieben zu wiederholen.
Nach der zweiten Zentrifugation wird das mitochondriale Pellet mit einem sauberen, flexiblen Schaber in den Resuspensionspuffer resuspendiert und die resuspendierten Mitochondrien mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze von einem Milliliter in einen Dounce-Homogenisator überführt. Mit dem Homogenisator die mitochondriale Suspension vorsichtig mit vier bis fünf Durchgängen homogenisieren. Verwenden Sie eine frisch geschnittene Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um die homogenisierte mitochondriale Suspension in ein beschriftetes Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
Für die mitochondrialen Atmungsmessungen der komplexen Substrate werden 945 Mikroliter des Atmungspuffers in die mitochondriale Atmungskammer gegeben. Stellen Sie sicher, dass sich der Rührer dreht, wenn die Puffertemperatur bei 37 Grad Celsius gehalten wird. Verschließen Sie die Kammer mit dem Deckel und beginnen Sie dann mit der Aufzeichnung der Datenerfassung.
Nachdem sich die Sauerstoffkonzentration stabilisiert hat, geben Sie 20 Mikroliter der mitochondrialen Suspension in die Kammer und setzen Sie den Deckel auf. Geben Sie in der Software an, dass die Mitochondrien der Kammer hinzugefügt wurden. Geben Sie je 10 Mikroliter eines molaren Glutamats, 200 Millimolar Malat und 200 Millimolar Pyruvat in die Kammer mit den einzelnen Spritzen und warten Sie, bis sich das Signal stabilisiert hat, bevor Sie die hinzugefügten Substrate in der Software anzeigen.
Verwenden Sie eine separate Spritze, um fünf Mikroliter Adenosindiphosphat (ADP) in die Kammer zu geben. Markieren Sie den hinzugefügten ADP in der Software und beobachten Sie den schnellen Sauerstoffverbrauch von Zustand drei. Nachdem sich die Atmung des dritten Zustands und der mitochondriale Sauerstoffverbrauch um vier Minuten verlangsamt haben, um die Atmung des vierten Zustands anzuzeigen, beenden Sie die Aufzeichnung und speichern Sie die Datendatei.
Für die beiden komplexen Substrate wiederholen Sie den Vorgang, indem Sie 963 Mikroliter des Atmungspuffers in die Kammer geben. Nach Zugabe von 20 Mikrolitern der mitochondrialen Suspension werden nacheinander zwei Mikroliter mit vier Mikrogramm pro Mikroliter Rotenon und 10 Mikroliter 500-millimolares Succinat mit den separaten Spritzen in die Kammer gegeben. Wenn sich das Signal stabilisiert hat, geben Sie die Substratzugabe in der Software an.
Beobachten Sie bei der Zugabe von fünf Mikrolitern ADP den schnellen Sauerstoffverbrauch des dritten Zustands und geben Sie die Zugabe von ADP in der Software an. Nachdem sich die Atmung des dritten Zustands und der mitochondriale Sauerstoffverbrauch um vier Minuten verlangsamt haben, um die Atmung des vierten Zustands anzuzeigen, beenden Sie die Aufzeichnung und speichern Sie die Datendatei. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die Rohdaten der mitochondrialen Atmung.
Die steile Steigung der dritten Stufe in den komplexen Substraten stellt die hohe maximale Atmungsrate dar. Die erfolgreiche Isolierung der Mitochondrien aus dem Skelettmuskel der Hintergliedmaßen wurde durch die scharfe Kurve und die Stabilisierung einer neuen Steigung des vierten Zustands beobachtet. Ein ähnliches Muster konnte für die komplexe zwei-gesteuerte mitochondriale Atmung beobachtet werden.
Die schlechte Funktion der Mitochondrien führte zur Kopplung der Mitochondrien für die komplexe mitochondriale Atmung. Ein weiteres typisches Beispiel für eine schlechte Funktion der Mitochondrien zeigte jedoch die entkoppelte Komplex-Zwei-Mitochondrien-Atmung mit einer flachen Linie nach der Zugabe von ADP und keine Wende, um die Daten des Zustands vier zu erzeugen. Aus den Atmungsmessdaten wurden die Zahlenwerte des Zustands drei, des vierten Zustands und des Atmungskontrollverhältnisses (RCR) für Komplex eins und Komplex zwei bestimmt. Während der Entnahme können zusätzliche Gewebe schockgefroren werden, um sie in Zukunft zur Messung der Mitochondriendichte oder oxidativer Schäden zu verwenden.
Darüber hinaus können nach dem Eingriff auch isolierte Mitochondrien eingefroren werden, um die Aktivitäten des Elektronentransports und der Kettenkomplexe zu messen. Die Fähigkeit, die mitochondriale Atmung im Feld zu isolieren und zu messen, wird den Weg ebnen, um unser Verständnis der Rolle von Mitochondrien in der Evolution komplexen Lebens zu verbessern.
