Parce que le poumon héberge un système immunitaire très complexe et unique, plusieurs stratégies de contrôle pour l’identification des cellules immunitaires pulmonaires ont été développées et rapportées. L’existence de plusieurs approches différentes rend difficile la comparaison des résultats générés par différents laboratoires. Notre stratégie de contrôle fournit un moyen complet et reproductible d’identifier jusqu’à 12 populations immunitaires myéloïdes et non myéloïdes pulmonaires différentes à l’aide de neuf marqueurs.
Le présent protocole décrit la caractérisation et l’identification des populations immunitaires pulmonaires dans des conditions d’équilibre. Cependant, ce protocole peut être utilisé pour identifier les changements de ces populations cellulaires dans divers modèles de maladie, où il peut aider à identifier les changements spécifiques à la maladie du paysage immunitaire pulmonaire. Les chercheurs qui pratiquent cette technique pour la première fois devraient faire attention aux conditions de digestion et aux réactifs, car ils font une grande différence dans la libération de cellules immunitaires du tissu pulmonaire.
Commencez par préparer l’animal euthanasié à la chirurgie. Stabilisez la souris dorsalement en utilisant des aiguilles ou du ruban adhésif sur les quatre extrémités, puis utilisez de l’éthanol à 70% pour désinfecter la peau de la zone ventrale. Faites une incision du cou à l’abdomen.
Retirez la peau de la région thoracique, ainsi que les côtes et le sternum. Rincez les poumons en injectant 10 millilitres de PBS froid dans le ventricule droit à l’aide d’une aiguille de calibre 18 à 21 jusqu’à ce qu’ils deviennent complètement blancs. Ensuite, retirez le thymus et le cœur sans toucher les poumons.
Détachez les poumons des tissus environnants et transférez-les dans un tube contenant un tampon BSA froid. Transférez le poumon dans une boîte de Pétri, hachez-le à l’aide de deux scalpels fins, puis placez-le dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter cinq millilitres de tampon de digestion pour laver la plaque.
Fixez le couvercle du tube et digérez le poumon pendant 30 minutes sur un agitateur orbital à une vitesse de 150 rotations par minute à 37 degrés Celsius. Arrêtez la réaction en ajoutant 10 millilitres de tampon BSA froid. Après la digestion, mélanger et dissoudre les morceaux de poumon à l’aide d’une aiguille de calibre 18.
Placez une passoire filtrante de 70 micromètres sur un nouveau tube conique de 50 millilitres et transférez le mélange pulmonaire digéré dans la passoire. Utilisez le côté en caoutchouc d’un piston de seringue de 10 millilitres pour briser les morceaux de poumon restants sur le filtre et lavez-le avec un tampon BSA. Centrifuger la suspension monocellulaire à 350 G pendant huit minutes à sept degrés Celsius.
Jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules dans un millilitre de tampon de lyse ACK. Mélanger la suspension à l’aide d’une pipette d’un millilitre et l’incuber pendant 90 secondes à température ambiante. Ajouter 10 millilitres de tampon BSA froid au mélange réactionnel et le centrifuger à 350 G pendant sept minutes à quatre degrés Celsius.
Jetez le surnageant, remettez la pastille dans un tampon de coloration et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 5 millions de cellules par millilitre pour la coloration de surface. Transférez 1 million de cellules dans 200 microlitres par puits dans une plaque de 96 puits et centrifugez la plaque à 350 G pendant sept minutes à quatre degrés Celsius.
Préparer une solution de bloc de cytométrie en flux en diluant l’anticorps anti-1632 dans un tampon de coloration. Remettre en suspension les cellules dans 50 microlitres de la solution de bloc de cytométrie en flux. Incuber la suspension pendant 15 à 20 minutes à quatre degrés Celsius ou sur de la glace.
Ensuite, ajoutez 150 microlitres de tampon de coloration à la plaque et centrifugez-la de 350 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Préparer une solution d’anticorps de surface en diluant les anticorps de surface dans un tampon de coloration. Resuspendez les cellules dans 50 microlitres de la solution d’anticorps de surface et incubez la plaque à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.
Ensuite, lavez les cellules deux fois avec un tampon de coloration. Préparer le tampon de fixation et de perméabilisation en mélangeant trois parties de fixation et de diluant de perméabilisation et une partie de tampon de coloration. Remettez les cellules en suspension dans 50 microlitres du tampon pré-préparé par puits de la plaque de 96 puits et incubez-les pendant 20 à 25 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.
Diluer le tampon de perméabilisation avec de l’eau désionisée purifiée pour préparer une fois le tampon de perméabilisation et l’utiliser pour laver les cellules. Préparer une solution d’anticorps intracellulaire en diluant avec un millilitre de tampon de perméabilisation. Remettre les cellules en suspension dans 50 microlitres de la solution d’anticorps intracellulaire diluée par puits de la plaque de 96 puits et incuber pendant 40 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.
Lavez les cellules avec un tampon de perméabilisation, puis avec un tampon de coloration. Après le lavage final, remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon de coloration. Acquérir un minimum de 1,5 million de cellules par échantillon sur le cytomètre en flux.
Après une chirurgie réussie et une procédure postopératoire appropriée, les débris et les doublets ont été exclus par une stratégie de contrôle. Les cellules immunitaires ont été identifiées à l’aide du marqueur hématopoïétique CD45+ par cytométrie en flux. Les cellules ont été distinguées comme vivantes ou mortes.
Les cellules pulmonaires immunitaires ont été classées en trois groupes à l’aide d’anticorps anti-GR-1 et anti-CD68. Les neutrophiles ont été identifiés et vérifiés en utilisant Ly6G comme marqueur unique. La population CD45+ contient également des cellules tueuses naturelles, des cellules T et des cellules B.
Ces cellules ont été colorées et vérifiées par des anticorps tueurs naturels 1.1, CD3 et B220. Le lavage broncho-alvéolaire a identifié des éosinophiles positifs pour le marqueur CD11b et des macrophages alvéolaires qui n’exprimaient pas des niveaux élevés de CD11b. Des cellules dendritiques CD45+ ont été trouvées et confirmées par l’expression de CD24.
Ces cellules ont montré une réponse positive ou négative envers les marqueurs CD103 et CD11b. Les cellules CD103 négatives ont été classées comme des cellules dendritiques conventionnelles et dérivées de monocytes sur la base de l’expression de CD64. les cellules dendritiques dérivées des monocytes étaient faiblement positives pour le marqueur dendritique CD24 et positives pour le marqueur pan-macrophage CD64.
Les macrophages interstitiels avec des monocytes classiques et non classiques ont été distingués sur la base de l’expression cd64 et GR-1. Ces cellules ont montré une expression positive pour le récepteur de chimiokine CX3C. Les étapes les plus importantes de cette procédure sont la collecte appropriée des tissus, la digestion et la préparation de la suspension unicellulaire, ainsi que le contrôle des cellules vivantes et des singlets.
En plus de caractériser les cellules immunitaires du poumon par cytométrie en flux, la culture cellulaire et les tests fonctionnels peuvent être effectués dans des populations cellulaires isolées. Cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs pour explorer de nouvelles questions dans les maladies du poumon, telles que les infections, les maladies auto-immunes et le cancer.
