Haemophilus influenza est une cause majeure d’inflammation dans diverses maladies pulmonaires chroniques, y compris la BPCO et la pneumonie. Ce protocole décrit des méthodes pour évaluer l’effet de l’haemophilus sur l’inflammation pulmonaire. Les avantages de cette technique sont qu’elle permet une évaluation complète des réponses immunitaires innées et adaptatives.
Incuber 450 microlitres de sang périphérique avec 50 microlitres d’un iodure de propidium activé marqué H influenzae dans un tube de cinq millilitres pendant 20 minutes au bain-marie à 37 degrés Celsius. Retirez l’échantillon du bain-marie, ajoutez cinq microlitres de DHR et de vortex pendant 10 secondes. Ensuite, replacez-le au bain-marie pendant encore 10 minutes.
Après avoir retiré l’échantillon du bain-marie, lyser les érythrocytes avec cinq millilitres de solution de chlorure d’ammonium à 0,8% et analyser les échantillons sur un cytomètre en flux comme décrit dans le texte. Diviser l’échantillon de sang périphérique en aliquotes pour le contrôle et la stimulation de l’antigène. Ajouter des anticorps costimulants aux deux échantillons.
Ajoutez ensuite le virus H influenzae non typable à l’échantillon d’antigène et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Ensuite, ajoutez l’agent bloquant de Golgi brefeldin A aux échantillons et incuberez-les pendant cinq heures supplémentaires. Après avoir lysé les érythrocytes comme démontré précédemment, fixer les leucocytes en utilisant 500 microlitres de un à 2% de para-formaldéhyde pendant une heure.
Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, puis perméabiliser 1 million de cellules avec 100 microlitres de saponine à 0,1% pendant 15 minutes. Ensuite, incuber les cellules avec des anticorps marqués fluorescents appropriés. Lavez les cellules, puis analysez-les à l’aide d’un cytomètre en flux.
Déterminer la proportion de cellules répondant à l’antigène en obtenant les populations de lymphocytes pertinentes. Effectuer une coloration de fond sur les cellules non stimulées pour toutes les cytokines à analyser. Trancher environ 20 à 40 grammes de l’échantillon de lobectomie en trois à cinq coupes de millimètres cubes.
Placez-les dans une chambre stérile de 50 microlitres et fragmentez mécaniquement le tissu à l’aide d’un désagrégateur approprié. Après la désagrégation des tissus, lyser les globules rouges comme démontré et remettre les cellules en suspension dans un RPMI stérile. Ensuite, filtrez les cellules à travers un treillis de nylon stérile de 100 micromètres et comptez les cellules viables en utilisant la méthode d’exclusion du bleu de trypan.
Pour le test d’infection, remettre en suspension les cellules pulmonaires dans RPMI à une concentration finale de 4 millions de cellules par millilitre et par tube. Ensuite, infectez les cellules à un MOI de 100 bactéries par cellule. Desserrez le bouchon d’une demi-rotation pour permettre le transfert de gaz dans les tubes.
Placez les cellules dans le rotateur tubulaire et incuberez-les à 37 degrés Celsius tout en tournant à 12 RPM. Une heure après la stimulation, ajoutez de la grefeldine A pour empêcher l’exportation extracellulaire des cytokines et incuber les suspensions cellulaires pendant 16 à 22 heures supplémentaires avec rotation. Le lendemain, laver la suspension cellulaire avec 500 microlitres de PBS contenant 1% d’albumine sérique bovine et 0,01% d’azoture de sodium.
Ensuite, colorez la suspension cellulaire pour des marqueurs de surface cellulaire de lymphocytes humains spécifiques pendant une heure. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS et fixez-les et perméabilisez-les comme démontré précédemment. Ensuite, incuber les cellules avec des anticorps de coloration de cytokines intracellulaires pendant une heure.
Ensuite, lavez les cellules et remettez-les en suspension dans 100 microlitres de PBS avant l’acquisition des données sur un cytomètre en flux. Mesurer la protéolyse via l’action des métalloprotéinases, ajouter un substrat de gélatine marqué à la fluorescéine directement sur les lames de coupe de tissu pulmonaire. Placez les lames horizontalement et incuberez-les dans une chambre humidifiée protégée par la lumière à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Pour préparer les témoins négatifs, ajouter un tampon de réaction x sans gélatine fluorescente aux sections pour une analyse plus approfondie. Les cellules mononucléées du sang périphérique ont été fermées en utilisant la dispersion vers l’avant et sur le côté pour définir la population phagocytaire. La population de phagocytes a été définie par l’expression de CD14 pour marquer les monocytes.
La mesure des ROS a été réalisée par oxydation de DHR 123 pour produire une fluorescence. La fluorescence médiane de l’échantillon stimulé a été comparée au témoin. La production de cytokines intracellulaires par les lymphocytes a été mesurée par cytométrie en flux.
Les cellules ont d’abord été analysées pour leur expression du marqueur leucocytaire CD45, puis pour CD trois et CD quatre, CD huit. Les cellules CD trois, CD quatre positives ont été évaluées pour la production intracellulaire de cytokines dans des échantillons témoins et stimulés. L’activité de la protéase a été mesurée par zymographie NC deux dans des coupes de tissu pulmonaire non fixées.
La coloration fluorescente indiquait la présence d’une activité MMP, qui était également colocalisée avec l’expression de la chromatine. L’ajout d’anticorps aux échantillons de tissu pulmonaire nécessite une concentration et la coloration des cellules nécessitera une optimisation dans les expériences préliminaires. Le surnageant des échantillons de tissu pulmonaire peut être analysé plus en détail pour d’autres médiateurs inflammatoires en utilisant des techniques telles que ELISA et Ces techniques peuvent être utilisées pour évaluer l’effet des thérapies potentielles sur l’inflammation pulmonaire.
