L’objectif global de cette étude est d’obtenir une imagerie 2D time-lapse de l’activité phagocytique dans les cellules mammaires mammaires M1 Macrophages 4T1 dans les co-cultures. Le modèle de co-cultures des cellules de vie a été établi et observé à l’aide d’une combinaison de microscopie fluorescente et différentielle de contraste d’interférence. L’évaluation de l’activité de phagocytose par des macrophages étaient image;utilisant le logiciel d’imagerie pour doubler la vidéo de laps de temps de plusieurs points, avant d’atesting notre incubation.
La question que nous avons menée sur le point de répondre aux besoins et aux avantages de l’affûtage dans le comportement des macrophages et son activité phagocytique avec les cellules cancéreuses. Plus précisément dans l’étude est le carcinome mammaire de souris. La première partie de cette étude commence par le modèle de co-culture des cellules vivantes des cellules mammaires 4T1 de carcinomes mammaires de souris et des macrophages de souris RAW 2647.
Commencez l’expérience en culturant 41 cellules mammaires de carcinomes de souris et macrophages de souris RAW 2647. Tout d’abord, décongeler un flacon de 4T1 et RAW 2647 cellules. Diluer les cellules décongelées en 10 millimètres dans un tube conique de 15 mill.
Ensuite, centrifugeuse les cellules à 660 g de force pendant 5 minutes pour obtenir des pastilles cellulaires. Aspirez soigneusement le média, suspendez les cellules dans 8 moulins de médias complets et transférez les cellules dans le flacon de culture tissulaire. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 pour cent de dioxyde de carbone.
Après une semaine de culture dans des conditions d’adhésion, surveillez le flacon tous les jours et complétez avec des supports complets atmil au besoin. L’étape suivante se poursuit avec l’immunostaining des macrophages RAW polarisés M1 2647. Cette étape consiste à assurer une polarisation complète des macrophages M1.
Comme la confluence de RAW 2647 a atteint 70 à 80 pour cent jeter les médias de culture et rincer doucement deux fois avec PBS. Préparer les macrophages pour les récupérer en délogeant doucement les cellules adhérentes à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférer dans un tube conique de 50 moulins. Comptez les cellules à l’aide d’hémocytomètre et préparez une cellule suspendue à une densité de 100 000 cellules par plat en ajoutant la solution restante à la densité assise.
Asseyez-vous 2 moulin de suspension macrophages en deux plats d’imagerie. Incuber les cellules 2 à 3 heures à 37 degrés Celsius avec 5 pour cent de dioxyde de carbone pour permettre l’adhérence cellulaire. Préparer les supports de polarisation M1 en ajoutant 100 nilligrammes par moulin LPS et 20 nilligrammes par interféron-gamma de moulin dans un milieu complet complété par 10 pour cent de FBS.
Jetez les cultures supernatant des macrophages incubés avant et lavez soigneusement les monomères dans le plat deux fois à l’aide de PBS. Ajouter 2 moulins de médias de polarisation M1 dans l’un des plats assortis et permettre aux cellules dura d’infuser dans le finnatype macrophages M1. Avant d’immunostaining, fixer les cellules macrophages RAW et M1 à l’aide de 2 moulins de 4 pour cent de paraformaldéhyde et d’incuber pendant 50 minutes à température ambiante.
Retirez le supernatant et lavez les cellules monocouches à l’aide de PBS, au moins trois fois. Étanchez avec 2 moulins de chlorure d’ammonium de 50 millimètres dans PBS et incubez pendant 50 minutes à température ambiante. Permeabilize utilisant 0,3 pour cent Triton X-100 en PBS pendant 50 minutes dans la température ambiante.
Étape de blocage utilisant 10 pour cent de FBS pendant 30 minutes dans la température ambiante de PBS. Incuber avec des anticorps anti-iNOS conjugués FITC dans PBS et un pour cent FBS nuit à 4 degrés Celsius. Incuber 1 moulin de DAPI dans des plats d’imagerie pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius dans un état sombre en couvrant de papier d’aluminium.
Laver les cellules à l’aide de PBS au moins 3 fois et ajouter 1 moulin de DMEM dans la vaisselle assortie et prêt pour l’imagerie fluorescente. L’étape suivante procède à l’ensemencement des cellules mammaires mammaires de carcinome de souris 4T1. Comme la confluence des cellules 4T1 atteindre 70 à 80 pour cent jeter le média de culture et rincer doucement deux fois avec PBS.
Ajouter 1 moulin de trypsine préchauffée pour désafhéser les cellules et incuber jusqu’à 20 minutes à 37 degrés Celsius. Une fois que les cellules semblent dés-fixées, transférer les cellules désa-attachées à un tube conique de 15 moulins. Et ajouter 2 moulins de milieu complet préchauffé pour inactiver le tube vu.
Centrifugeuse à 600 g de force pendant 5 minutes pour obtenir une pastille cellulaire. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau les granulés dans 10 échantillons de DMEM avant lerun de l’usine. Comptez les cellules à l’aide d’hémocytomètre et de graines 100 000 cellules dans le moulin DMEM.
Dans l’imagerie ceux-ci avec TC traité. L’étape suivante consiste à étiqueter les carcinomes mammaires de souris 4T1 vivants à l’aide de taches CFSE. Tout d’abord, retirez les supports existants du plat d’imagerie qui était auparavant ensemencé avec des cellules 4T1.
Préparer la solution de coloration cfse en diluant la coloration CFSE dans 1 usine PBS pour faire 5 macrmal sur le travail consenttif. Ajouter 1 moulin de solution de coloration cfse dans le plat d’imagerie pour incuber les cellules pendant 20 minutes à température ambiante ou 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Ajouter un égal de DMEM aux cellules plus la solution de coloration et laisser semer pendant 5 minutes.
L’étape suivante consiste à semer des macrophages de souris RAW2647 et à co-culture avec le 4T1. Après le nivellement par cfse des cellules 4T1, lavez le plat d’imagerie deux fois, à l’aide de PBS. Graine 2 moulin de suspension de macrophages dans le plat d’imagerie 4T1.
L’étape suivante consiste à polariser les macrophages RAW 4627 en finnatype M1. Ajouter 2 moulins de médias de polarisation M1 dans le plat imagine et permettre aux cellules RAW d’infuser dans le finnatype macrophage M1. La deuxième partie de l’étude est l’évaluation en accéléré des cellules 4T1 phagocyted macrophages M1.
L’étape suivante comprend l’évaluation de la phagocytose par microscopie vidéo à cellules vivantes. Tout d’abord, allumez le microscope. Réglez la température à 37 degrés Celsius.
Et 5% de dioxyde de carbone. Placez les cellules de co-culture au centre de la scène et vissez doucement sur la chambre supérieure. Utilisez le joystick pour motoriser la scène en sélectionnant différentes positions à capturer.
Il y a beaucoup de facteurs doivent être considérés tout en exécutant l’imagerie de cellules vivantes. Pour obtenir une vidéo assez petite. Il nécessite l’optimisation de l’exposition à l’imagerie, la mesure du temps et aussi l’automatisation de la correction de mise au point.
Dans le cas où la vidéo est sur-exposée, intervalle de temps incorrect, et aussi hors de discussion, coûtera la vidéo pour être inutilisable. La répétition de l’expérience doit être faite si l’un de ces facteurs a été détecté. La figure 1 montre des immunofluorescences tournant avec l’anti-iNOS en vert.
Marqueur nucléaire DAPI en bleu. Et des versions améliorées de la plupart des images. Film 1 est un film représentatif live-cell de comprendre les macrophages M1 et 4T1.
CfSE taché la plupart des carcinomes mammaires cellules co-cultures capturées à l’aide de l’acquisition multicanal de florescent et la microscopie IC. Film 2 films de microscopie vidéo à cellules vivantes à partir de plusieurs points dans un seul plat conjugal. Montrant la phagocytose de 4T1 par macrophages M1 induits.
Les images ont été capturées à intervalles de 50 minutes pendant 13 heures. Film 3 film de microscopie vidéo à cellules vivantes, d’un seul point de coordonnées choisi pour montrer une visualisation en profondeur de la phagocytose de 4T1 par M1 Macrophages. Flèches rouges montre à M1 macrophages, cercle jaune montre qu’un certain nombre de cellules 4T1 étancher le fluorène et goffman de cellules 4T1.
Les macrophages M1 se déplacent-ologie décrivent comme porocytoplasme étaient comme 4T1 carcinomes de mémoire de souris ont une morphologie d’épithélium. Les macrophages peuvent être vus se déplaçant pour ajouter des cellules 4T1 pour établir le contact cellule-cellules. Qui est ensuite suivie par l’absorption de cellules 4T1 par macrophages M1.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension sur la façon d’effectuer des expériences de microscopie vidéo à cellules vivantes;avec le carcinome mammaire de souris 4T1 et raw 2647 macrophages merad. Vous devriez également en mesure de mettre en place au cours de la nuit co-cultures des deux types de cellules pour effectuer essai phagocytosis. Vous devez également comprendre comment les co-cultuers de 4T1 avec LPS et interféron-gamma macrophages.
