L’optogénétique a été utilisée pour obtenir des titres plus élevés de plusieurs produits chimiques et protéines par rapport aux inducteurs typiques. En utilisant ce protocole, d’autres peuvent améliorer leurs propres processus avec un contrôle basé sur la lumière. Le contrôle optogénétique est non invasif, hautement réglable et réversible.
Ces qualités permettent une optimisation rationalisée des processus microbiens et ouvrent même des opportunités uniques, comme les fermentations triphasées et le contrôle multichromatique. Pour tout nouveau produit chimique, les conditions d’éclairage optimales seront différentes. Donc, si une faible production est observée en utilisant les paramètres de ce protocole, différentes conditions d’éclairage doivent être testées.
Commencez par obtenir une souche de Saccharomyces cerevisiae avec l’oxytrophie HIS3, un marqueur nécessaire aux plasmides OptoINVRT. Si vous cherchez à contrôler un gène natif de Saccharomyces cerevisiae, assurez-vous que la copie endogène du gène est supprimée avant de continuer. Pour commencer la construction de la souche, linéariser le plasmide contenant le circuit OptoINVRT7, tel que EZL439.
Si vous utilisez EZL439, qui contient les composants pour réprimer le PIGA un promoteur à la lumière et l’activer dans l’obscurité, linéariser sur le site de restriction Pme1. En utilisant des méthodes standard de transformation de l’acétate de lithium, intégrez le plasmide dans une souche auxotrophique HIS3. Après la transformation, centrifugez les cellules à 150 G pendant une minute.
Ressuspendez doucement les cellules dans 200 microlitres de milieu SC-HIS frais. Plaquez tout le volume cellulaire sur une plaque de gélose SC-HIS et incubez à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours jusqu’à l’apparition de colonies. Préparer des cellules compétentes à l’aide de protocoles standard de transformation de l’acétate de lithium.
Transformez les cellules avec le plasmide contenant les gènes que vous souhaitez contrôler optogénétiquement en aval des promoteurs PIGA1M ou PIGA1S. Après la transformation, centrifuger la culture à 150 G pendant une minute et remettre doucement en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de milieu de chute SC frais. Plaquer tout le volume cellulaire sur une plaque de gélose peptone dextrose extraite de levure, si elle s’intègre dans des sites Delta ou une plaque de décrochage SC si elle se transforme avec un plasmide contenant un marqueur de sélection.
Incuber les cellules à 30 degrés Celsius pendant 16 heures sous une lumière bleue constante pour maintenir le gène contrôlé optogénétiquement réprimé. Utilisez n’importe quelle source lumineuse de longueur d’onde de 465 nanomètres et placez un panneau LED à environ 40 centimètres au-dessus de la plaque de sorte que l’intensité lumineuse soit d’environ 80 à 110 micromoles par mètre carré et par seconde. Mesurez l’intensité à l’aide d’un compteur quantique.
En cas d’intégration dans des sites Delta, répliquez la plaque sur des plaques d’extrait de peptone dextrose contenant une plage de concentrations de Zeocin comprise entre 400 microgrammes par millilitre et 1 200 microgrammes par millilitre pour sélectionner une variété de numéros de copie d’intégration. Incuber les plaques de réplique à 30 degrés Celsius sous une lumière bleue constante ou pulsée pendant deux à trois jours jusqu’à l’apparition des colonies. Pour effectuer le dépistage préliminaire, sélectionnez huit colonies de chaque plaque et utilisez-les pour inoculer un millilitre de milieu SC-HIS complété par 2% de glucose dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits.
Cultivez les cellules pendant la nuit à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tours par minute sous un éclairage constant de lumière bleue. Le lendemain, diluer chaque culture dans un milieu SC-HIS frais avec 2% de glucose pour obtenir les valeurs de densité optique allant de 0,01 à 0,3 à 600 nanomètres et faire croître les cultures à l’état d’agitation de 200 tours par minute sous une lumière constante ou pulsée à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que la densité optique atteigne entre deux et neuf. Ensuite, enveloppez les plaques avec du papier d’aluminium, éteignez le panneau lumineux et incubez les plaques dans l’obscurité pendant quatre heures à 30 degrés Celsius avec 200 tours par minute.
Centrifuger les cultures dans la plaque de 24 puits à 234 G pendant cinq minutes et remettre en suspension les cellules dans un millilitre de milieu de chute complet synthétique frais avec 2% de glucose. Scellez les plaques pour éviter l’évaporation du produit souhaité à l’aide d’un ruban d’étanchéité stérile à microplaques. Fermenter les plaques scellées dans l’obscurité pendant 48 heures à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tours par minute.
Pour récolter les fermentations, centrifugez les plaques pendant cinq minutes à 234 G et transférez 800 microlitres du surnageant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Selon le produit chimique d’intérêt, analysez en utilisant la chromatographie liquide à haute performance, la spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse ou une autre méthode analytique utilisant la technique de préparation de l’échantillon la mieux adaptée à l’instrument utilisé. Sélectionnez huit colonies dans chaque plaque et utilisez-les pour inoculer un millilitre de milieu SC-HIS avec 2% de glucose dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits.
Cultivez les cellules pendant la nuit dans l’obscurité à 30 degrés Celsius avec 200 tours par minute de secousse. Le lendemain matin, diluer chaque culture dans un milieu SC-HIS frais avec 2% de glucose à 0,1 densité optique. Enveloppez les plaques dans du papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière et cultivez la culture dans l’obscurité à 30 degrés Celsius avec 200 tours par minute d’agitation jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité optique de trois.
Ensuite, incubez les plaques sous une lumière pulsée pendant 12 heures à 30 degrés Celsius avec 200 tours par minute en secouant. Centrifuger les cultures à 234 G pendant cinq minutes et remettre en suspension dans un milieu SC-HIS frais avec 2% de glucose. Scellez les plaques pour éviter l’évaporation du produit souhaité à l’aide d’un ruban d’étanchéité stérile à microplaques.
Fermenter les plaques scellées à la lumière pendant 48 heures à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tours par minute. Après avoir effectué des fermentations optogénétiques, la production chimique a été testée à une gamme de densités cellulaires au moment de l’induction avec deux circuits. Le circuit OptoINVRT7 a démontré des titres élevés d’acide lactique et d’isobutanol avec une densité cellulaire optimale de valeur d’induction de 7,0 et 8,75 par rapport aux circuits OptoINVRT1 et 2.
Les fermentations utilisant les circuits OptoAMP ont été étudiées en trois phases définies par différents cycles de légèreté. La production d’acide lactique peut être optimisée à l’aide d’une phase de croissance pulsée et de phases d’induction et de production entièrement éclairées. La production d’isobutanol a été optimisée en utilisant une phase de croissance pulsée, une phase d’induction entièrement éclairée et une phase de production pulsée.
Alors que la biosynthèse de la naringénine a été mieux optimisée en utilisant une induction de croissance pulsée entièrement éclairée et une phase de production sombre. Le système OptoLAC a été utilisé chez E.Coli pour produire un facteur de transcription FDER à des titres comparables ou supérieurs à ceux obtenus en utilisant l’induction chimique avec IPDG. Des circuits OptoLAC ont été appliqués pour produire du mévalonate et la production dépasse les titres obtenus par induction IPDG.
La production de mévalonate au niveau du bioréacteur démontre l’évolutivité et l’accordabilité de la régulation optogénétique pour la production de produits chimiques et de protéines dans les bactéries au-delà des niveaux de microplaques. Il est important de s’assurer que l’intensité lumineuse est dans la plage appropriée pour les marches éclairées et que la contamination lumineuse est évitée pour les étapes qui nécessitent de l’obscurité. Cette technique a ouvert la voie à l’obtention de titres records d’isobutanol dans la levure, stabilisé les populations de consortiums avec la lumière et même contrôler le flux métabolique à l’aide d’organites synthétiques contrôlés par la lumière.
