Cette méthode peut aider à la présélection des clones chromosomiques par pichia pastoris souches exprimant des protéines recombinantes dans des conditions dépressées par une simple secousse flacon cultures avant l’échelle. Le principal avantage de cette technique est que l’expression des protéines libres de méthanol de haut niveau peut être réalisée à l’aide de Pichia pastoris, qui est soutenu par la surveillance en ligne exacte des paramètres de culture importants. En général, les personnes nouvelles à cette méthode peuvent avoir du mal parce que le point de temps pour démarrer l’alimentation de culture du verre doit être adapté aux caractéristiques de croissance de la souche de production spécifique.
Avant de mettre en place la culture principale, ensemencer une seule colonie fraîche de la souche d’expression d’intérêt dans 5 ml de pepto de levure et de bouillon dextrose dans un tube conique de 50 ml. Laissez le couvercle légèrement ouvert pour permettre une bonne aération. Que, placer la culture dans un shaker à 28 degrés Celsius, 80% d’humidité et 100 à 130 RPM pendant la nuit.
Le lendemain matin commencer le logiciel pour connecter les appareils via Bluetooth. Ensuite, appuyez sur le bouton argent sur le devant de l’appareil de mesure de la biomasse pour activer la connexion Bluetooth à l’appareil et cliquez sur trouver des appareils dans le logiciel de surveillance informatique. Faites glisser et déposer les périphériques trouvés sur les carrés du plateau de mesure et cliquez sur connectez-vous.
Lorsqu’une connexion réussie est effectuée, un écran de contrôle s’affiche. Pour configurer une expérience, cliquez sur démarrer la mesure. Nommez l’expérience et vérifiez si tous les paramètres requis pour la surveillance sont activés.
Réglez l’intervalle à trois minutes et la moyenne des points de mesure à 11. Entrez les noms des échantillons et sautez l’étalonnage d’angle. Mesurer la densité cellulaire de la culture nocturne diluée à un rapport d’un à vingt dans le milieu de culture dans un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nanomètres.
Inoculer 50 ml de milieu avec la culture du jour au lendemain à un OD 600 de 05. Que, placer les flacons dans les détecteurs à 28 degrés Celsius, 130 RPM et 80% d’humidité pendant cinq minutes. Cliquez sur la mesure de démarrage dans le logiciel.
Quatre heures après l’inoculation, utilisez un échantillon de 2 ml pour mesurer la densité cellulaire comme nous venons de le démontrer. Lorsque la concentration d’oxygène approche de zéro et que les cellules sont en phase de croissance exponentielle, ajoutez quatre disques d’alimentation glycérol à chaque flacon dans des conditions stériles. Que, retourner les flacons à l’incubateur secouant pour un supplément de 60 à 90 heures.
Prélevez des échantillons toutes les 24 heures pour surveiller la densité cellulaire et l’expression des protéines par l’analyse de choix. À la fin de la culture, transférer les cultures en tubes coniques de 50 ml pour centrifugation. Exportez les données de mesure en ligne comme un fichier de feuille de calcul à partir du logiciel pour une analyse plus approfondie.
Dans cette culture représentative, la concentration de glycérol de départ était de 5%Bien que les disques d’alimentation aient été ajoutés lorsque la biomasse augmentait de façon exponentielle, l’oxygène a diminué à presque zéro. Des concentrations plus faibles de glycérol ont réduit l’effet des limitations à court terme d’oxygène et sont donc recommandées pour l’expression dépressée de protéine. Dans cette expérience représentative dans laquelle l’hormone de croissance humaine a été exprimée sous le contrôle d’une source de carbone réprimée promoteur sur l’épuisement du glycérol l’expression protéique par la répression a été assurée par l’ajout de quatre disques d’alimentation par flacon.
Comme prévu, l’expression de l’hormone de croissance humaine et le développement de la biomasse ont augmenté au fil du temps en présence des disques d’alimentation glycérol, tandis que l’expression des protéines a diminué au fil du temps et la biomasse est restée constante en l’absence du supplément de glycérol. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’observer attentivement les paramètres de culture pour déterminer une heure de début d’expression optimale. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme l’analyse des taches occidentales de détermination de la concentration protéique ou des analyses d’activité peuvent être effectuées pour l’évaluation du rendement protéique ainsi que des expériences bioréacteurs à petite échelle pour répondre à d’autres questions sur la performance de la souche individuelle à plus grande échelle.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de l’expression des protéines recombinantes libres de méthanol pour explorer une alternative prometteuse au promoteur AOX1 dépendant du méthanol couramment utilisé sur Pichia pastoris.
