Ici, nous avons fourni un protocole pour mesurer la teneur en non-hème dans les tissus animaux. En utilisant un test colorimétrique simple et bien établi qui peut être mis en œuvre facilement dans la plupart des laboratoires. Le test colorimétrique à base de bathophénanthroline ne nécessite pas de compétences sophistiquées ou d’équipement très coûteux et peut être adapté au format microplaque pour un débit d’échantillon et une rentabilité plus élevés.
Ce protocole est adapté pour détecter les altérations des niveaux de fer tissulaire dans une variété de modèles animaux expérimentaux de surcharges en fer ou d’efficacité du fer. Commencez par couper un échantillon de tissu pesant de 10 à 100 grammes avec une lame de scalpel. Pesez-le avec précision dans une balance analytique sur un petit morceau de parafilm.
Utilisez une pince à épiler en plastique pour placer le morceau de tissu dans une plaque de 24 puits. Laissez-le sécher sur un incubateur standard à 65 degrés Celsius pendant 48 heures. Alternativement, placez le morceau de tissu à l’aide d’une pince à épiler dans une tasse en téflon sans fer et séchez-le dans le four de digestion au micro-ondes du laboratoire.
Placez chaque morceau de tissu séché sur un petit morceau de paraforme à l’intérieur d’une balance analytique et pesez-le avec précision. Transférer chaque morceau de tissu séché dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajouter un lit du mélange acide au tube et le fermer.
Préparez un blanc acide de la même manière, sauf que le tissu est omis ici. Incuber les tubes à 65 degrés Celsius pendant 20 heures pour digérer le tissu. Après refroidissement à température ambiante, utilisez une micro-pipette équipée d’embouts en plastique pour transférer 500 microlitres de l’extrait acide clair dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.
Préparez les réactions de chromogène directement dans les microficles de polystyrène transparents à fond plat de 96 puits et non traités. Température ambiante incubée pendant 15 minutes. Mesurer l’absorbance de l’échantillon dans un lecteur de plaques à une longueur d’onde de 535 nanomètres par rapport à une référence d’eau désionisée.
La détermination du fer non hémique par la cuvette et les tests colorimétriques à base de microplaques à 96 puits sont présentés ici. La corrélation entre les niveaux de fer non hémique à base de cuvette et de microplaques dans 55 échantillons de tissus de mâles noirs âgés de six mois, six souris, y compris le foie, la rate, le cœur, les poumons et la moelle osseuse sont montrés ici. La forte corrélation entre les deux méthodologies indique que la méthode à base de microplaques est une alternative valable à la méthode originale à base de cuvette.
Enfin, les niveaux de fer non hémique ont été quantifiés avec la méthode à base de microplaques après digestion acide d’échantillons dérivés des mêmes tissus avec un mélange d’acide chlorhydrique et d’acide trichloroacétique ou d’acide chlorhydrique seul. La forte corrélation montre que l’acide trichloroacétique peut être émis par la digestion acide. L’image représentative montre les niveaux de fer non hémique dans le foie, la rate, le cœur et le pancréas de souris mâles noires de type sauvage six et de souris knock-out d’hepcidine mâle sur fond génétique noir six mesuré avec un test colorimétrique à base de bathophénonthroline.
La perturbation de l’hepcidine conduit à une hémochromatose comme le phénotype de dépôt de fer avec une accumulation sévère de fer hépatique, pancréatique et cardiaque et une déplétion de fer splénique. Les niveaux de fer hépatique non hémique chez le bar européen femelle juvénile après modulation expérimentale du fer sont montrés ici. Les niveaux de fer hépatique ont augmenté massivement chez les animaux traités au fer.
Alors que l’anémie a provoqué une légère réduction des réserves hépatiques de fer. Les images représentatives montrent les niveaux de fer non hémique chez la drosophile âgée d’un mois mesurés avec un test colorimétrique à base de bathophénanthroline. Les résultats montrent la teneur en fer non hémique dans chaque pool de 20 mouches ou la teneur estimée en fer de chaque mouche.
Considérant un poids moyen de 0,64 milligrammes par mouche. Lorsque vous tentez cette procédure, n’oubliez pas de nettoyer soigneusement toute l’usure du verre et de ne pas laisser les matériaux de laboratoire métalliques entrer en contact avec un réactif ou une solution en raison du risque de contamination.
