Ce protocole montre comment la technique du rideau d’ADN est utilisée pour étudier la dynamique de la chromatine, en particulier pour étudier la fonction moléculaire des chaperons d’histones. La technique d’imagerie à haut débit d’une seule molécule d’ADN permet de surmonter les limites des expériences en vrac et facilite l’imagerie en temps réel, permettant la caractérisation détaillée des interactions entre les biomolécules. Mettez un papier propre de dimension 5 par 35 millimètres au centre du ruban adhésif double face.
Fixez le ruban adhésif sur la diapositive pour couvrir les deux trous et les nano-motifs avec le papier. Retirez ensuite le papier à l’aide d’une lame propre. Placez une lamelle de verre sur le ruban adhésif double face et frottez la lamelle de protection à l’aide d’une pointe de pipette pour former une chambre microfluidique.
Placez la cellule d’écoulement assemblée entre deux lames de microscope et clipsez-les. Faites cuire la cellule d’écoulement dans un four sous vide à 120 degrés Celsius pendant 45 minutes. Fixez le connecteur de fluide pour l’analyse à base de puce à chaque trou ouvert à l’aide d’un pistolet à colle chaude.
Et connectez les deux lignes de tubes de verrouillage du leurre. Branchez une seringue contenant trois millilitres d’eau déminéralisée et lavez la chambre. Lavez à nouveau la chambre avec trois millilitres de tampon lipidique via une connexion goutte à goutte.
Injectez un millilitre de lipide biotinylé 0,04x dans le tampon lipidique, dans la chambre, en deux fois, avec une incubation de cinq minutes par injection. Injectez 0,025 milligramme par millilitre de streptavidine dans un millilitre de BSA, avec deux injections et une incubation de 10 minutes par injection. Injecter environ 30 picomolaires d’ADN de phage lambda biotinylé dans un millilitre de tampon BSA, dans la chambre avec deux injections et des incubations de 10 minutes par injection.
Connectez une seringue contenant 10 millilitres de tampon d’imagerie à un pousse-seringue et éliminez les bulles dans toutes les conduites de tubulure du système microfluidique. Couplez la cellule d’écoulement préparée avec le système microfluidique via une connexion goutte à goutte pour éviter l’injection de bulles dans la cellule d’écoulement. Assemblez la cellule d’écoulement et les supports de cellule d’écoulement, et montez l’ensemble sur un microscope à fluorescence à réflexion interne totale construit sur mesure.
Injecter 200 microlitres de colorant YOYO-1 dans le tampon d’imagerie à travers 100 microlitres de boucle d’échantillon pour colorer les molécules d’ADN Lambda. Exécutez un logiciel d’imagerie et allumez le laser de 488 nanomètres pour vérifier si les rideaux d’ADN sont bien formés. Une fois que le colorant YOYO-1 a été retiré, injectez l’échantillon de protéine pré-incubé.
Lorsque les protéines atteignent le rideau d’ADN, éteignez le pousse-seringue, fermez la vanne d’arrêt et incubez pendant 15 minutes pour la charge d’histones par Abo1. Lavez les protéines Abo1 et histones non liées pendant cinq minutes. Arrêtez temporairement le flux tampon pour vérifier si les protéines histones sont chargées sur l’ADN.
La formation d’un rideau d’ADN a été vérifiée en colorant les molécules d’ADN avec un colorant interpolant. Les lignes vertes montrées dans des réseaux parallèles indiquaient que YOYO1 intercalé en molécules d’ADN étaient bien alignés et étirés au niveau d’une barrière de diffusion sous écoulement hydrodynamique. Lorsque des dimères Cy5-H3-H4 ont été injectés dans le rideau d’ADN en l’absence d’Abo1, Cy5-H3-H4 ne s’est pas lié à l’ADN, ce qui indique une absence de liaison spontanée des dimères H3-H4 à l’ADN.
Lorsque Cy5-H3-H4 a été injecté avec Abo1, des particules fluorescentes rouges ont été observées sur les molécules d’ADN, ce qui suggère qu’Abo1 charge des dimères H3-H4 sur l’ADN. Les signaux fluorescents ont disparu en l’absence d’écoulement tampon et sont réapparus lorsque le flux a été repris, ce qui suggère que les dimères H3-H4 se lient à l’ADN. La liaison des dimères H3-H4 à l’ADN a également été confirmée par le kymographe, dans lequel les signaux de fluorescence disparaissaient chaque fois que le flux était coupé.
Peu de particules fluorescentes sont apparues dans le rideau d’ADN, soit en l’absence de nucléotide, soit en présence d’ADP, ce qui indique que les dimères H3-H4 se lient rarement à l’ADN, que ce soit à l’état Apo ou en présence d’ADP. L’analyse quantitative montre que le nombre de dimères H3-H4 liés à l’ADN augmente en présence d’ATP. Les résultats suggèrent que l’hydrolyse de l’ATP est essentielle pour le chargement de H3-H4 sur l’ADN par Abo1.
Éviter l’injection de bulles dans la cellule d’écoulement est le plus critique pour toutes les étapes. Ainsi, dans ce protocole, nous mettons l’accent sur les connexions goutte à goutte. Le test de rideau d’ADN peut être étendu aux rideaux d’ADN à double attache avec deux nano-motifs.
De plus, nous pouvons fabriquer un autre type de rideau d’ADN avec des filaments d’ADN simple brin, d’ARN ou d’actine. Le rideau d’ADN permet de visualiser le mouvement des protéines sur l’ADN et facilite l’étude du mécanisme de recherche de cibles. Le rideau d’ADN peut être étendu pour étudier le métabolisme de l’ADN, y compris la réplication et la transcription.
