Ce protocole permet l’évaluation de la fonction mitochondriale à l’intérieur du nerf par parcellation des mitochondries isolées, une procédure difficile dans un petit tissu qui contient un nombre limité de mitochondries. La technique offre la possibilité d’analyser simultanément les fonctions mitochondriales telles que la consommation d’oxygène et la production de ROS dans une mitochondrie préservée in situ. Avec plusieurs substrats, inhibiteurs et protocoles de conception de découpleurs.
Plusieurs maladies partagent la fonction mitochondriale, en particulier les neuropathies induites par le diabète de type deux ou la chimiothérapie. Dans ces maladies, les altérations de la phosphorylation oxydative mitochondriale sont le seul signe qui dicte le développement de la maladie. Cette méthode fournit des informations sur la neurobiologie, la biochimie et la pharmacologie, avec l’étude des mécanismes de la maladie mitochondriale, la recherche de thérapies, telles que les boosters mitochondriaux ou la douleur neuropathique améliorée.
Pour commencer, calibrez les capteurs d’oxygène en pipetant 2,1 millilitres de tampon MR dans chaque chambre. Fermez-le avec les bouchons et aspirez l’air dans la chambre jusqu’à ce qu’une bulle se forme. Remuer à 37 degrés Celsius pendant une heure en mode d’étalonnage jusqu’à ce que le flux d’oxygène par masse se stabilise.
À l’aide du logiciel HRR, effectuez un étalonnage de l’air des capteurs d’oxygène polarographiques conformément aux instructions du fabricant. Pour la préparation des tissus, placez le nerf sciatique dans une boîte de Petri avec suffisamment de tampon TP pour le couvrir. Tenez une extrémité du nerf avec une pince et avec une autre paire de pinces, retirez les faisceaux nerveux horizontalement.
Tout d’abord, transférez le tissu affiché dans un petit plat contenant un tampon TP millilitre pour la perméabilisation des tissus. Pour commencer la perméabilisation, transférez le tissu avec une pince dans un autre plat contenant un millilitre de tampon TP, contenant 50 microgrammes par millilitre de saponine. Placez la plaque dans un agitateur à microplaques et laissez-la remuer doucement pendant 30 minutes.
Ensuite, transférez le tissu avec une pince dans un plat frais contenant un tampon MR d’un millilitre et laissez-le remuer doucement pendant 10 minutes. Transférer le tissu avec une pince dans une chambre HRR calibrée. Remplissez les chambres HRR avec 2,1 millilitres de tampon MR.
Ajouter Amplex Red et peroxydase à une concentration finale de cinq micromolaires et de deux unités par millilitre, respectivement. Ensuite, ajoutez le nerf sciatique perméable. Fixez les capteurs fluorescents de l’instrument.
Ensuite, éteignez les lumières dans la section de contrôle du logiciel et cliquez sur se connecter à l’oxygraphe"Aller à modifier les protocoles » dans le logiciel et insérez le poids du tissu. Allez dans la mise en page et choisissez l’option « flux spécifique par unité d’échantillon ». Sélectionnez ensuite des graphiques pour accéder simultanément à la lecture de la consommation d’oxygène et, si nécessaire, à la production de peroxyde d’hydrogène.
Attendez environ 10 minutes. Injecter deux impulsions de peroxyde d’hydrogène, chacune à une concentration finale de 260 micromolaires pour l’étalonnage de la chambre. Injectez 20 microlitres de succinate, un substrat du complexe mitochondrial II, pour activer le système de transport d’électrons mitochondriaux.
Ajouter 20 microlitres d’ADP pour activer la synthèse de l’ATP. Dans l’ordre, ajoutez cinq microlitres de cytochrome c comme indicateur de l’intégrité de la membrane. Titrer avec des aliquotes de 0,2 microgramme par millilitre d’oligomycine jusqu’à ce qu’aucune autre diminution de la consommation d’oxygène ne soit observée.
Titrer avec des aliquotes de 0,5 micromoles par litre de FCCP, le découpleur mitochondrial, jusqu’à ce qu’aucune autre augmentation de la consommation d’oxygène ne soit observée. Pour terminer l’expérience, injectez deux microlitres d’antimycine A, faites une concentration finale de cinq millimolaires et attendez que le flux se stabilise. Accédez à la barre de commandes.
Recherchez multisensoriel"dans le logiciel. Cliquez sur ctrl"puis appuyez sur enregistrer le fichier » et déconnectez-vous. Ouvrez le fichier enregistré et sélectionnez le flux d’oxygène par plateau de masse pour obtenir les résultats de la consommation expérimentale d’oxygène.
Sélectionnez manuellement la fenêtre entre les injections en appuyant sur le bouton Maj+gauche de la souris. Accédez aux marques et sélectionnez les statistiques pour visualiser les résultats de chaque injection de substrats, d’inhibiteurs et de protocole de découpleur. Pour la production de peroxyde d’hydrogène, effectuez la même procédure avec la trace de pente de l’ampère.
La diminution du potentiel membranaire favorisée par l’activité de l’ATP sythase a accéléré la consommation d’oxygène. L’ajout de cytochrome C exogène n’a favorisé qu’une stimulation minimale de la respiration, certifiant l’intégrité de la membrane externe mitochondriale pour cette préparation. Des flux absolus d’oxygène ont été enregistrés et seulement une augmentation de 6,3% a été observée dans la respiration, indiquant une bonne qualité de la préparation des tissus.
La consommation d’oxygène et la production de ROS ont été mesurées simultanément en présence de différents substrats fournissant du carburant pour le système de transport d’électrons. L’ajout de pyruvate et de malate pour le complexe mitochondrial I a augmenté la respiration. Et l’ajout supplémentaire de succinate pour le complexe II augmente également la consommation d’oxygène.
Par conséquent, d’autres substrats pourraient être testés. La production de ROS a également augmenté, indiquant la fuite d’oxygène du système de transport d’électrons. L’ajout d’adénosine diphosphate en concentration saturante a augmenté la consommation d’oxygène entraînant la formation d’ATP et diminuant la production de ROS.
En revanche, le titrage oligo a diminué la consommation d’oxygène et augmenté la production de ROS. Cela suggérait que le nerf sciatique perméabilisé pourrait reproduire la relation standard dans la physiologie mitochondriale. L’ajout de FCCP et de rétinone, alignés sur les changements attendus du flux d’oxygène, confirme que la physiologie mitochondriale et le profil bioénergétique ont été préservés dans le nerf sciatique perméabilisé.
L’étape la plus importante consiste à préparer doucement la section de tissu, à s’assurer que toutes les ouvertures de la chambre sont correctement nettoyées. Les altérations de la fonction mitochondriale pourraient être dues à un dysfonctionnement ou à un nombre mitochondrial inférieur. par conséquent, l’activité de la synthase citée et la confirmation de la teneur en ADN mitochondrial par PCR sont recommandées.
