Ces protocoles permettent aux chercheurs d’aller au-delà de la simple mesure de la consommation d’oxygène mitochondrial, et permettent plutôt la mesure des produits finaux mitochondriaux clés, de l’ATP et des espèces réactives de l’oxygène. Le principal avantage de cette technique est que l’investigateur peut mesurer l’efficacité mitochondriale en comparant directement le taux de consommation d’oxygène au taux de production du produit final. Si le produit final est l’ATP ou l’oxygène réactif.
Les techniques nécessitent une attention particulière aux détails, en particulier pour éviter les bulles. Qu’elles soient dans la chambre respiratoire ou dans les seringues de titrage, les bulles sont votre ennemi car elles rendent les mesures moins précises. Après avoir obtenu les biopsies des muscles squelettiques.
Remplissez les chambres du respiromètre avec un média sans magnésium et scellez la chambre d’incubation. Réglez la température d’incubation de l’instrument à 38 degrés Celsius pour représenter la température basale du muscle squelettique équin. Et réglez le mélange du milieu respiratoire à 750 tr/min en utilisant une agitation magnétique tournant dans le fond de la chambre du respiromètre.
Ensuite, éteignez l’éclairage de la chambre pour éviter les interférences avec les capteurs fluorescents. Mettez l’électrode d’oxygène sous tension de polarisation de 800 millivolts et amplifiez le signal résultant avec un réglage de gain de un. Enregistrer la concentration d’oxygène toutes les deux secondes et calculer le flux d’oxygène comme la pente négative de la mesure de l’oxygène sur les 40 secondes suivantes.
Ensuite, calibrez le capteur d’oxygène en permettant au média de s’équilibrer avec l’air ambiant. Calculer la pression partielle d’oxygène de référence en fonction de la pression barométrique mesurée par le respiromètre à haute résolution et de la concentration atmosphérique standard d’oxygène. Utilisez des capteurs fluorescents verts pour quantifier le signal fluorescent de la chambre respiratoire.
Mettez les capteurs sous tension de 400 à 500 millivolts et le signal résultant est amplifié avec un gain de 1 à 1 000. Ensuite, ajoutez TMRM à la chambre respiratoire avant d’ajouter des mitochondries et calibrez le signal fluorescent en utilisant un simple étalonnage en deux points du signal fluorescent par rapport à la quantité de fluorophore ajoutée avant l’ajout des mitochondries. Effectuer l’étalonnage final du signal TMRM après l’achèvement du protocole de titrage de la respirométrie en délivrant plusieurs titrages de l’agent de découplage jusqu’à ce qu’aucune autre augmentation du signal fluorescent TMRM ne soit observée, indiquant l’effondrement complet du potentiel de membrane mitochondriale.
Utilisez des capteurs fluorescents bleus pour quantifier le signal fluorescent de la chambre respiratoire et mettez ces capteurs sous tension pour que les instruments individuels capturent le signal attendu dans la plage linéaire du capteur. Ajoutez huit microlitres d’EDTA à deux millimolaires dans la chambre respiratoire pour chélater les cations qui entreraient en compétition avec les ions magnésium pour se lier au vert de magnésium. Ensuite, ajoutez quatre microlitres d’un millimolaire vert de magnésium à la chambre respiratoire.
Calibrer le signal fluorescent brut avec des titrages séquentiels de 100 millimolaires de chlorure de magnésium de 100 millilitres, en permettant une minute entre les titrages pour stabiliser le signal fluorescent. Déterminer le taux de synthèse de l’ATTP qui est la pente de la concentration d’ATP au fil du temps tout au long du protocole. Utilisez des capteurs fluorescents verts pour quantifier le signal fluorescent de la chambre respiratoire.
Mettez les capteurs sous tension de 300 à 400 millivolts. Et le signal résultant est amplifié avec un gain de 1 à 1 000. Optimisez les paramètres spécifiques pour les instruments individuels afin de capturer le signal attendu dans la plage linéaire du capteur.
Avant d’ajouter les mitochondries, effectuez la configuration chimique et l’étalonnage initial du test Amplex UltraRed. Ajouter 30 micromoles de DTPA aux cations chélatés qui pourraient interférer avec la réaction. Ajoutez ensuite la superoxyde dismutase ou la serratus peroxydase et Amplex UltraRed dans la chambre de respirométrie.
Laissez le signal fluorescent se stabiliser. Ajoutez ensuite 0,2 micromole de peroxyde d’hydrogène deux fois avec un intervalle de cinq minutes. Effectuer des étalonnages supplémentaires en deux points tout au long de l’essai pour permettre l’ajustement de la réactivité de l’essai à mesure que la chimie de la respirométrie change tout au long de l’essai avec le moment précis de ces points d’étalonnage à la discrétion de l’investigateur.
Vortex l’échantillon pour maintenir une suspension d’échantillon uniforme et ajouter 15 microlitres de suspension mitochondriale isolée à chaque chambre d’incubation de deux millilitres afin que les résultats représentent le rendement mitochondrial de 18,75 milligrammes de muscle. Avant d’ajouter des substrats, mesurez la consommation d’oxygène résiduel et soustrayez cette valeur des valeurs de consommation d’oxygène de chaque étape du titrage inhibiteur non couplé du substrat ou du protocole SUIT après l’achèvement. Utilisez un SUIT à usage général qui permet la caractérisation initiale de la fonction mitochondriale du muscle squelettique équin.
Commencez par des titrages séquentiels de pyruvate, de glutamate et de malate l’un dans l’autre dans chaque chambre pour produire du nicotinamide adénine dinucléotide et stimuler la respiration non phosphorylante soutenue par le NADH oxydé par une fuite complexe à base unique. Ensuite, ajoutez de l’ADP pour stimuler la respiration phosphorylante par une respiration phosphorylante complexe. Ajouter du succinate pour produire une respiration phosphorylante en combinant la respiration phosphorylante complexe un et complexe deux Ajoutez de la roténone pour bloquer le complexe.
Le flux d’oxygène résultant représente la capacité du complexe deux à soutenir la consommation d’oxygène mitochondrial par l’oxydation du succinate seul. Une trace de pneumométrie à haute résolution de la respiration mitochondriale du muscle squelettique équin et du potentiel membranaire relatif est montrée. Les valeurs respiratoires des mitochondries incubées avec TMRM sont plus faibles en raison d’un effet inhibiteur de ce fluorophore.
La respiration mitochondriale et la synthèse ATTP du muscle squelettique équin contenant un pourcentage élevé de fibres musculaires squelettiques de type un riches en mitochondries et incubées dans des conditions proches du métabolisme au repos sont montrées. Une trace de pneumométrie de la respiration mitochondriale du muscle squelettique équin et de la production de peroxyde d’hydrogène est montrée. La respirométrie haute résolution demande beaucoup de patience.
La personne qui exécute le test aura de nombreux moments où elle devra porter un jugement quant à savoir si un état stable a été atteint et si la prochaine étape peut se produire. Nous n’avons démontré qu’un seul protocole de titrage. Il existe des dizaines d’autres protocoles qui peuvent être appliqués de la même manière pour répondre à des questions spécifiques concernant le métabolisme mitochondrial.
