Cette procédure répondait au besoin d’une collecte simple et fiable de vésicules extracellulaires dérivées de cellules souches mésenchymateuses et d’une application dans l’application de la recherche. La collecte de vésicules extracellulaires par centrifugation différentielle est simple, facilement évolutive et reproductible, ce qui sera utile au domaine. Les vésicules extracellulaires indistinctes des cellules souches mésenchymateuses indistinctes sont une application indistincte dans les traitements modernes des maladies.
Je n’aurai pas peur des erreurs. Cette opération est simple et facile à apprendre. Il y a beaucoup de détails dans ce programme simple qui peuvent être mieux présentés par vidéo.
Pour commencer, la culture des cellules souches mésenchymateuses à plus de 90% de confluence. Remplacer le milieu de culture dans chaque boîte par 8 mL d’alpha-MEM supplémenté. Après 48 heures de culture, les cellules doivent être cultivées uniformément pour recueillir complètement le milieu de culture dans des tubes à centrifuger de 50 mL.
Ensuite, centrifuger le milieu de culture à 800 x g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le surnageant dans des tubes coniques de 1,5 mL pour éliminer les fragments cellulaires et les débris cellulaires. Centrifuger le surnageant à 16 000 x g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.
Utilisez une pipette pour transférer la suspension sur des tubes à ultracentrifugation. Ensuite, centrifuger à 150 000 x g pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Remettez en suspension la pastille de microvésicule dans 50 uL de PBS par boîte.
Jetez le surnageant et recueillez le résidu, qui est des exosomes. Resuspendre les exosomes de sept boîtes de cellules dans 50 uL de PBS. Dans un tube de 15 mL, diluer 1 uL de vésicules extracellulaires dans 1 499 uL de PBS et mélanger.
Ensuite, démarrez le logiciel compatible pour l’analyseur de suivi. Remplissez la cellule d’échantillon avec de l’eau distillée, puis laissez l’instrument démarrer la vérification de la cellule. Calibrer l’instrument avec une solution étalon préparée.
Assurez-vous que le nombre de particules affiché sur l’interface de détection du logiciel est compris entre 50 et 400, de préférence autour de 200, puis cliquez sur OK. Ensuite, rincez la cellule d’échantillon avec 5 mL d’eau distillée. Avant l’analyse de l’échantillon, rincer le canal avec 1 mL d’eau distillée.
Assurez-vous que le nombre de particules affiché sur l’interface de détection du logiciel est inférieur à 10. Dans un tube conique de 1,5 mL, remettre en suspension les vésicules extracellulaires avec 250 uL de PBS. Dans un autre tube conique de 1,5 mL, préparer la solution de travail du colorant PKH26.
Mélanger les vésicules extracellulaires en suspension avec la solution de travail. Laissez-le reposer à température ambiante pendant cinq minutes, puis ajoutez 500 uL de FBS appauvri en EV pour arrêter la réaction. Pour les microvésicules, centrifuger à 16 000 x g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.
Jetez le surnageant. Ajouter 1 mL de PBS pour rincer le résidu. Centrifuger à nouveau et jeter le surnageant pour enlever le colorant non lié.
Pour les microvésicules, centrifuger à 16 000 x g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Remettez le résidu en suspension avec 200 uL de PBS. Déposez 20 uL de suspension sur la lame et observez-la au microscope à fluorescence.
Resuspendre les vésicules extracellulaires dans 200 uL de PBS, puis mélanger avec une solution d’héparine à un rapport volumique de 10:1. Placez la souris dans le système d’imagerie de la veine caudale. Appuyez sur l’interrupteur pour soulever le levier.
À l’aide d’un illustrateur de veine de la queue, effectuez une injection systématique de la suspension de vésicule extracellulaire à travers la veine de la queue. L’analyse de la distribution granulométrique à l’aide de NTA a démontré que la taille des exosomes des cellules souches mésenchymateuses humaines variait de 40 à 335 nm, avec une taille maximale d’environ 100 nm. En outre, la taille des microvésicules variait de 50 à 445 nm, avec une taille de pic de 150 nm.
La caractérisation morphologique des exosomes a montré qu’ils présentaient une forme de coupe typique. Les vésicules extracellulaires ont été efficacement marquées par PKH26, qui a été observée par la vue brute comme des pastilles marquées, ainsi que par microscopie fluorescente. L’opérateur doit faire attention lors de la collecte du surnageant, car les cellules doivent être soufflées uniformément pour recueillir complètement les VE libérés retenus dans l’indistinction des cellules souches mésenchymateuses.
Afin de vérifier le succès de l’injection, une imagerie in vivo de la biodistribution de VE marqués par fluorescence ou de sections congelées de sites tissulaires spécifiques de greffe peut être effectuée.
