Transduire des thymocytes immatures avec des vecteurs rétroviraux et cultiver ces cellules sur des cellules stromales OP9 DL4 est une technique difficile. Ce protocole détaillé permettra aux chercheurs d’économiser du temps et des efforts tout en optimisant ces systèmes. Cette technique fournit un système in vitro flexible pour étudier les effets des modifications génétiques sur les cellules T immatures et peut être utile pour étudier le développement des cellules T et le cancer.
La démonstration de la procédure sera Gisele Rodrigues, une boursière postdoctorale de mon laboratoire. Pour commencer, ensemencer les cellules productrices de rétrovirus 18 à 24 heures avant la transfection à 70 à 90% de confluence dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à six puits contenant deux millilitres de cellule productrice de rétrovirus, ou milieu RPC. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Pour transfecter les cellules, remplacez le milieu par un milieu RPC frais une heure avant la transfection. Préparer les mélanges de lipofection en diluant quatre microgrammes d’ADN contenant deux microgrammes de plasmide auxiliaire pCL-Eco et deux microgrammes de plasmide de transfert pMIG dans 250 microlitres de milieu sérique réduit et mélanger délicatement. Ensuite, mélangez 10 microlitres de réactif de transfection et 250 microlitres de milieu sérique réduit et incuber pendant cinq minutes à température ambiante.
Après cinq minutes d’incubation, combiner l’ADN dilué avec le réactif de transfection dilué. Mélanger délicatement et incuber pendant 20 à 25 minutes à température ambiante. Ajouter doucement les 500 microlitres du mélange d’ADN et de réactif de transfection dans le puits contenant les cellules productrices de rétrovirus en les déposant sur les cellules avec un mouvement circulaire.
Mélangez doucement en balançant l’assiette d’avant en arrière, puis incuber l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. Environ 16 heures après la transfection, remplacer l’ancien milieu par deux millilitres de milieu RPC frais et continuer à incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 20 à 24 heures. Pour préparer la suspension unicellulaire de thymocytes, placez un thymus récolté de souris euthanasiées dans cinq millilitres de PBS dans une boîte de Pétri.
À l’aide de lames de verre stériles, placez le thymus entre les surfaces givrées des lames et frottez doucement les lames ensemble, en roulant le thymus entre les deux lames. Rincez les lames de verre pour recueillir les cellules et éliminer le tissu stromal thymique restant. Filtrer cinq millilitres de la suspension thymique à travers un filtre à crépine de 30 ou 40 micromètres et centrifuger les cellules à 300 G pendant 10 minutes.
Après avoir retiré le surnageant, lyser les globules rouges en ajoutant un millilitre d’un tampon de lyse ACK par tube pendant une minute. Ajouter cinq millilitres de tampon d’épuisement cellulaire pour désactiver le tampon de lyse ACK, centrifuger la suspension à 300 G pendant 10 minutes et remettre en suspension dans un à cinq millilitres de tampon d’épuisement cellulaire pour compter. Après avoir compté les cellules et centrifugé à 300 G pendant 10 minutes, remettre les cellules en suspension à une fois 10 à la septième fois dans 80 microlitres de tampon d’épuisement cellulaire.
Ajouter 10 microlitres de microbilles CD4 et CD8 par une fois 10 aux septièmes cellules. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes dans le noir au réfrigérateur. Ensuite, préparez une colonne d’épuisement en la rinçant avec deux millilitres de tampon d’épuisement et en jetant le flux continu.
Lavez les cellules incubées en ajoutant un à deux millilitres de tampon d’épuisement par une fois 10 les sept cellules. Centrifuger à 300 G pendant 10 minutes et jeter le surnageant. Ensuite, appliquez la suspension cellulaire remise en suspension sur la colonne et collectez le flux continu des cellules non marquées.
Lavez la colonne deux fois avec un millilitre de tampon et recueillez le flux. Colorer les contrôles d’efficacité de déplétion en divisant les 200 microlitres de cellules collectées avant l’épuisement en quatre tubes FACS, non colorés, CD4 à simple coloration, CD8 à simple coloration et CD4 et CD8 à double coloration. Utilisez les échantillons non colorés et non colorés pour configurer les paramètres de cytométrie en flux.
Utilisez les 1 000 microlitres de cellules prélevées après l’épuisement pour colorer CD4 et CD8 et comparez-les avec l’échantillon à double coloration prélevé avant l’épuisement. Pour cultiver les thymocytes, placer deux à cinq fois 10 à la cinquième à une fois 10 à la sixième après la déplétion dans une fiole T25 de 80 à 90% de cellules OP9 DL4 confluentes dans un milieu OP9 contenant des cytokines. Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures sur des cellules OP9 DL4.
Pour récolter le rétrovirus, prélever le surnageant contenant les rétrovirus dans les cellules transectées en inclinant la plaque à six puits, puis en plaçant une seringue de trois à cinq millilitres au fond de la plaque tout en tirant sur le piston pour aspirer le surnageant. Filtrer le surnageant rétroviral à travers un filtre à seringue de 0,45 micromètre et recueillir le filtrat dans un tube de 50 millilitres. Remplacez le milieu par deux millilitres de milieu RPC frais et continuez à incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 20 à 24 heures pour la deuxième transduction.
recueillir les thymocytes de la culture OP9 DL4 par pipetage agressif pour éliminer les thymocytes et les cellules OP9 DL4 de la surface du flacon. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres pour éliminer la plupart des cellules OP9 DL4 et recueillir le filtrat dans un tube de 50 millilitres. Centrifuger les thymocytes et le filtrat à 300 G pendant cinq minutes et jeter le surnageant.
Resuspendre les thymocytes dans 0,5 à un millilitre de milieu OP9 avec des cytokines. Ajouter un à deux millilitres de milieu RPC contenant le virus. Ensuite, ajoutez le bromure d’hexaméthrine à huit microgrammes par millilitre de suspension cellulaire totale.
Spinoculer le contenu en centrifugeant les cellules à 850 G pendant une heure à température ambiante. Remettez les cellules en suspension dans six millilitres de milieu OP9 avec des cytokines par fiole et ajoutez la suspension sur la monocouche cellulaire OP9 DL4. Incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Répétez les étapes de la récolte des rétrovirus à l’aide d’un nouveau puits du surnageant cellulaire contenant le rétrovirus. Maintenir les thymocytes transduits sur culture OP9 DL4 pendant deux à cinq jours ou congeler au besoin. L’efficacité de la déplétion a été évaluée cytométriquement en marquant la fraction cellulaire magnétiquement non marquée pour CD4 et CD8 après séparation immunomagnétique des cellules et en l’analysant sur un diagramme de points bivariant bidimensionnel.
Un bon rendement de cellules doublement négatives pour CD4 et CD8 est de 95% ou plus, comme représenté ici. Lors de l’utilisation de vecteurs qui expriment des marqueurs filtrables tels qu’un gène de fluorescence, la transsection et la transduction peuvent être évaluées grossièrement et empiriquement par microscopie à fluorescence. L’efficacité de la transduction a été analysée en récoltant les thymocytes de la monocouche OP9 DL4.
et l’étude de l’expression d’un gène de fluorescence par cytométrie en flux. L’efficacité de la transduction à l’aide d’un vecteur rétroviral vide avec GFP comme gène rapporteur était de 84,2% de différenciation des cellules T sur les cellules OP9 DL4 a été observée quatre jours après la transduction. Analyse par cytométrie de flux de la différenciation cellulaire induite par la co-culture sur des cellules OP9 DL4 et l’expression transgénique, où les cellules ont été marquées pour CD4, CD8, CD44 et CD 25.
La transduction des thymocytes doublement négatifs avec le vecteur rétroviral vide pMIG présentait approximativement les mêmes proportions de positifs simples, de doubles positifs, de doubles négatifs, et ses sous-stades doublement négatifs de un à quatre que les thymocytes non transduits, ce qui indique que le développement des lymphocytes T n’a pas été affecté par le processus de transduction. La tâche la plus difficile lorsque l’on tente de reproduire ce protocole est de s’assurer que les différents types de cellules sont gérés simultanément de manière coordonnée. La surexpression des oncogènes dans les thymocytes immatures peut parfois affecter le développement normal des lymphocytes T, de sorte que l’immunophénotypage ultérieur par cytométrie de flux est un moyen utile d’apprendre quelle direction prendre.
Le potentiel oncogénique des lymphocytes T transduits différenciés sur les cellules de la couche fœtale peut être étudié plus avant par injection chez des souris immunodéprimées.
