Les auteurs sont particulièrement reconnaissants à Deborah Harris et Danielle MacKay. Prise en charge de ce travail a été fourni par le ministère de la biologie et de l&#39;Ordre des Arts et des Sciences de CWRU, et par HHMI subvention nombre 52005866 faveur de l&#39;éducation de premier cycle en sciences biologiques.

1. Méthodologie d&#39;imagerie <ol><li> Faire fondre la gelée de glycérine dans un bain d&#39;eau à 55 ° C degrés pendant 20-30 minutes jusqu&#39;à ce qu&#39;elle devienne un liquide homogène. Swirl, mais ne secouez pas la bouteille pour éviter la formation de bulles. </li><li> Alors que la gelée fond, appliquer une fine couche de glycérol à l&#39;aide d&#39;un Kimwipe sur une lame de verre propre (en option). </li><li> Pipette de 1 à 1,5 ml de glycérine fondue gelée à l&#39;aide d&#39;une pointe de pipette P1000 coupe sur la surface de la diapositive pour créer une première couche mince. Pipeter avec précaution pour éviter les bulles. </li><li> Laissez la gelée de solidifier pendant 5 min sur une surface horizontale, puis placer la lame à -20 ° C pendant 5 min et procéder à l&#39;alignement embryon. Alternativement, couvrir la lame avec le Saran Wrap et le placer à 4 ° C pendant 5 jours. </li><li> Introduire à la pipette une petite goutte d&#39;embryons colorés dans du glycérol 70% / PBS ou autres Antifade glycérol à base de milieu de montage (par exemple Slowfade ou Vectashield) sur le côté de la litière gelée. </li><li> Commencez pré-alignement des embryons parindividuellement les transférer à partir du menu à la surface gelée. Transférez-les à l&#39;aide d&#39;une aiguille hypodermique inclinée, en utilisant le côté incliné comme une cuillère. </li><li> Environ placer les embryons ainsi que 2 à 3 colonnes. Si un embryon se coince dans l&#39;aiguille, remuer dans la liste déroulante contenant les embryons d&#39;autres pour le libérer. Ne perdez pas de temps avec soin en les alignant à ce stade. Laissez de l&#39;espace entre les colonnes. </li><li> Aligner les embryons en les faisant glisser horizontalement sur le support gelée à l&#39;aide de l&#39;aiguille hypodermique. Tout en faisant glisser, orienter les têtes et les queues dans la même direction. Rendre parallèles les uns aux autres le long de la colonne. Enlever l&#39;excès de glycérol PBS laissé comme une traînée avec un morceau de Kimiwipe torsadée. Remarque: le glycérol en excès entraîne des embryons pour être lâchement enfermée à l&#39;intérieur du gel, ce qui entraîne la séparation des couches de gelée deux, ce qui rend difficile à découper et à monter. En revanche, la suppression de glycérol trop de sécher et aplatir embryons. </li><li> Utiliser un embout de coupe jaune pour diffuserune fine couche de gelée sur les embryons (50-150 ul, selon la façon dont beaucoup ont été alignés). </li><li> Placer la lame dans congélateur à -20 ° C pendant 10-20 min ou le stocker à 4 ° C pendant la nuit. Assurez-vous que la gelée est complètement rigide avant de couper. Sinon, le bloc d&#39;embryons sera très difficile à exciser. Les meilleurs résultats sont obtenus pour la coupe le lendemain. </li><li> Sous un microscope à dissection, utiliser une lame de rasoir pour couper complètement à travers la gelée sur les deux côtés des embryons alignés. Maintenez la lame de rasoir à un angle de 90 ° pour réaliser des coupes droites. Les coupes doivent être faites très près des pôles antérieur et postérieur de l&#39;embryon pour éviter les excès de gelée qui peuvent entraver l&#39;imagerie. </li><li> Ajouter 100-200 ul de froid PBT (4 ° C, PBS + 0,1% Tween 20) à côté des coupes et soigneusement gratter la gelée entre les embryons à l&#39;aide d&#39;une spatule. Remarque: Le détergent en PBT permet l&#39;élimination de la gelée de la glissière sans endommager les embryons. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un e aiguille, transferte bloc de gelée avec des embryons intégrés à une lame propre pour couper davantage. Couper les petits blocs avec des embryons 5-7. Utilisez PBT de se déplacer facilement autour du bloc de gelée. Sinon, placez le bloc sur une surface de verre sec pour laisser fixent sur le verre, ce qui crée plus de stabilité pour justement couper la gelée, le cas échéant. </li><li> Retourner verticalement les embryons noyées dans la gelée à l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir et une aiguille. Pour la visualisation au microscope, soit procéder à une des deux étapes ci-dessous, en fonction du type de Pied pour microscope utilisé. </li><li> Microscope inversé: fini les blocs d&#39;embryons lieu sur une lamelle de long, avec des embryons dans une position verticale. Faire en sorte que le côté de l&#39;embryon avec le moins de gelée sera en contact plus étroit avec l&#39;objectif. </li><li> Microscope droit: faire deux piles de quatre lamelles collées # 1 avec de la superglue pour être utilisé comme &quot;supports&quot; et placez le bloc d&#39;embryons dans du glycérol entre les «supports». Combler les piles à l&#39;aide d&#39;unlamelle longue. </li><li> Pour l&#39;analyse confocale, vérifiez la distance de travail des objectifs à utiliser pour savoir si vous pouvez l&#39;image tout au long de l&#39;embryon ou seulement partiellement. Par exemple, D. embryons ont melanogaster ~ 0,55 mm de longueur et peut être entièrement imagé en utilisant un Zeiss 20x plan-Apo ou un 40x LD Neo-Fluor objectif. Le site suivant contient des informations sur les objectifs Zeiss disponibles et vous donne la possibilité aux objectifs de recherche en fonction de distances de travail: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Les résultats représentatifs Parce que les embryons sont laissés intacts, cette méthode peut être utilisée pour effectuer des mesures précises de la taille des embryons et les distances entre les profils d&#39;expression génique. Dans la figure 1, nous montrons une embryons au stade blastoderme colorées avec du DAPI tache nucléaire (bleu), la protéine anti-dorsale (rouge), l&#39;ARNm sog (jaune) et l&#39;ARNm sna (vert). Proces morphologiques<html> session, comme l&#39;invagination du mésoderme (Figure 2A, B) et la migration des cellules mésodermiques (figure 3 et 4) peuvent également être visualisés à l&#39;aide de cette méthode. Différentes positions Z le long de l&#39;axe DV peut être obtenue en modifiant le plan focal, comme représenté sur les figures 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Upright tranche optique d&#39;un embryon intact au stade blastoderme. Double coloration pour l&#39;ARNm et de protéines. ARNm cibles pour sondes in situ (sog et sna) et colorées par la protéine anticorps primaire (anti-dorsale) sont indiqués sur la figure. DAPI est utilisé pour marquer les noyaux. Notez que l&#39;expression de sog et sna sont situés dans le cytoplasme apical, alors que l&#39;expression de la dorsale est d&#39;origine nucléaire. Des signaux forts de transcriptions SOG naissantes qui sont situés dans les noyaux peuvent aussi être vus à ce grossissement. 2175fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figure 2 &quot;/&gt; Figure 2. Imagerie verticale d&#39;une sonde d&#39;ARNm intacts gastrulating embryon. Utilisés et leurs couleurs respectives sont indiquées sur la figure. A) A noter que dans cette étape, trois gènes colorées avec la même fluor (sna, sog et dpp, en vert), sont exprimés dans des domaines séparés dans l&#39;espace. Le mésoderme invagination exprime sna, la couche de neuroblastes exprime salle et l&#39;ectoderme exprime dpp, tandis que l&#39;expression sog est toujours présente dans les régions ventrales du système nerveux. B) Dans un plan plus profond confocale de l&#39;embryon même, nous notons la base du mésoderme invagination exprime fortement sna, mais sa région apicale exprime des niveaux inférieurs. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Imagerie verticale d&#39;un embryon intact avec bande germe étendu sog ARN (jaune);. Escargot, salle et dpp </em&gt; ARNm (vert), la protéine dorsale (rouge). Les noyaux ont été colorées avec du DAPI (bleu). A) à plan focal près de la tête embryon. B) Un autre plan focal dans la région du tronc de l&#39;embryon même. Noter la masse de cellules mésodermiques avant la migration latérale (comparer à la figure 4) se trouvant à proximité de la ligne médiane ventrale sur les deux côtés d&#39;un embryon de germe de bande étendue. Neuroblastes délamination sont marqués en vert (ind et sna). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Imagerie verticale d&#39;un embryon intact pendant extension de bande germe sog ARN (jaune);. Escargot, salle ARNm et DPP (vert), la protéine dorsale (rouge). A) Notez les neuroblastes délamination de l&#39;épithélium (flèche), teinté à la fois pour salle et sna à ce stade (vert). On notera également l&#39;expression restreinte de SOG à la ligne médiane ventrale (jaune). L&#39;expression de dpp à ce stade peut être vu sur les côtés latéraux del&#39;embryon (astérisque). B) l&#39;article optique dans l&#39;embryon même représentée en A proximité de l&#39;extrémité de la longueur de l&#39;embryon, qui correspond à la mi-postérieur région. Les cellules sont colorées ligne médiane ventrale pour sog.

<ol>
	<li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos.">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li><li>Gr&#946;hans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila.">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li><li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol.">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li><li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila.">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li></ol>

Prendre des images des sections efficaces d&#39;embryons de drosophile peut être difficile, car elle nécessite soit une dissection minutieuse de la main tranches 2 ou l&#39;utilisation de médias intégrés pour le traitement microtome, qui est généralement néfaste pour les colorations fluorescentes. En variante, Z-empilements réalisés dans un microscope confocal permet de faire de la reconstruction 3D de section transversale des images. Cependant, il est temps de faire plusieurs tranches fines confocale pour une reconstruction 3D précise et photoblanchiment devient problématique. Un autre problème lorsque les embryons d&#39;imagerie qui sont montés longitudinalement est la diffusion de la lumière qui se produit lorsqu&#39;il atteint sections plus profondes de l&#39;embryon, ce qui complique également prendre des mesures précises de signaux fluorescents dans le but de quantifier les niveaux d&#39;expression de protéine ou d&#39;ARNm 1. Même avec un microscope à deux photons confocale, diffusion de la lumière est toujours un sujet de préoccupation en raison de l&#39;opacité de la matière jaune dans le milieu de l&#39;embryon, Qui permet la sélection de supports de montage pour une transparence optimale de l&#39;échantillon à être limitée. Pour contourner ces problèmes, une nouvelle technique appelée &quot;End-on&quot; l&#39;imagerie des embryons de positionnement vertical a été récemment mis au point à l&#39;image en direct et des échantillons fixes 4. Dans cet article, nous avons développé un nouveau protocole pour les embryons montés verticalement qui permet une préparation simple et la visualisation des embryons fixes ou des tissus de n&#39;importe quelle taille et la forme sont colorées avec de multiples sondes in situ 3. Notre procédé consiste à utiliser un support de montage avec consistance gélatineuse qui est utilisée pour envelopper embryons alignés à l&#39;intérieur de celui-ci. Couper des blocs de ce support de montage intégrés contenant des embryons peut être placé en position verticale avant l&#39;imagerie dans tout type de microscope confocal. En intégrant les embryons dans la gelée et les positionner à la verticale, nous sommes en mesure de prendre horizontales sections en utilisant la microscopie confocale, dans lequel les cellules along de l&#39;axe dorso-ventral de l&#39;embryon sont présentés simultanément. Il s&#39;agit d&#39;une amélioration significative des fins de quantification, car les problèmes de diffusion de la lumière et de photoblanchiment des colorants fluorescents qui se produit dans conventionnelle Z-stack reconstruction des embryons longitudinalement montés sont désormais éliminés. Ainsi, la quantification de l&#39;expression du gène ou de la teneur en protéines selon l&#39;axe dorso-ventrale est exacte, car les cellules situées à opposées dorsal-ventral positions sont imagés en même temps et à la même confocale Z-position. En outre, la méthode décrite permet d&#39;obtenir une complète 2-D image sur l&#39;axe dorso-ventral de l&#39;embryon 3-D sans utiliser de méthodes complexes de déroulage de calcul pour visualiser les cellules à différentes positions le long de l&#39;axe DV 6. Certaines des étapes essentielles incluent le retrait du glycérol en excès après alignement des embryons, afin d&#39;éviter répartis entre les deux couches de gelée. Toutefois, si l&#39;échantillon est trop déshydraté, le résultatment l&#39;image sera déformée et ont une morphologie incorrecte. En outre, si le milieu de la gelée autour de l&#39;embryon est coupé à un angle plutôt que droite, l&#39;image résultante peut apparaître moins rond et plus en forme ovulaire, en raison d&#39;un mauvais positionnement des embryons à un angle autre que 90 degrés. Enfin, si la gelée n&#39;est pas coupé assez près de l&#39;embryon sur les extrémités antérieure / postérieure, il n&#39;est pas possible d&#39;obtenir une image correcte car la distance de travail de l&#39;objectif serait principalement utilisé pour focaliser dans la gelée et pas l&#39;embryon. Une autre étape importante qui peut être nécessaire lorsque l&#39;imagerie embryon fin gastrulating est de bien trier les stades d&#39;intérêt dans le champ avant de les aligner. Habituellement, les embryons sont mis en scène en fonction des caractéristiques morphologiques qui peuvent être plus facilement reconnus lorsqu&#39;il est en position longitudinale. Parmi les modifications alternatives qui peuvent être faites avec cette méthode est d&#39;inclure un anti-faderéactif (par exemple p-phénylènediamine ou PPD) dans la seconde couche de gelée pour la protection contre le photoblanchiment de colorants fluorescents.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> Glycérine Jelly médias montage </td><td></td><td> Electron Microscopy Sciences Société </td><td> 17998-10 </td><td> Contient une faible concentration de phénol comme conservateur et doit être utilisé dans la hotte ou dans un endroit bien ventilé. Recette pour faire vos propres médias est décrite dans Zander, 1997. </td></tr><tr><td> Zeiss LSM 700 Confocal </td><td></td><td> Zeiss </td><td></td><td> Les objectifs suivants ont été utilisés: Plan-Apo 20x 0,8 M27 (DEO 0.55mm); CE Plan-Neofluar 40x 1,3 huile (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0,6 Korr 40X (WD 2.9mm). </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin à 0,1% De Tween 20 (PBT) </td><td></td><td></td><td></td><td></td><tr><td> Lames de microscope </td><td></td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-7 </td><td></td><tr><td> Lamelles de verre </td><td></td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 72204-02 </td><td> Taille 1 ½ (spécifique pour les objectifs utilisés dans ce travail). </td></tr><tr><td> Lamelles de verre (pour la fabrication des supports) </td><td></td><td> Fisherfinest </td><td> 12-544-10 </td><td> Utilisez quatre lamelles collées avec de la colle. </td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td></td><td> M5 sauvage Wild Heerbrugg Makroskop </td><td> M420 </td><td></td><tr><td> Lame de rasoir </td><td></td><td></td><td></td><td> Les lames en acier de bord en arrière simples industrielles </td></tr><tr><td> Spatule </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> 21-401-10 </td><td></td><tr><td> Aiguilles hypodermiques </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> 1482610 </td><td> Calibre 26 </td></tr&gt; <tr><td> Pipettes </td><td></td><td> Labnet </td><td></td><td></td></tbody></table></div>

upright imaging of drosophila embryos

Plusieurs gradients morphogénétiques connus et les mouvements cellulaires se produisent le long de l&#39;axe dorsal / ventral de l&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon. Cependant, les techniques actuelles utilisées pour afficher ces processus sont quelque peu limitées. Le protocole suivant décrit une nouvelle technique pour le montage fixées et marquées<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons à des fins de visualisation coronale avec l&#39;imagerie confocale. Cette méthode consiste à incorporer embryons entre deux couches de supports de montage gelée de glycérine, et bandes de gelée d&#39;imagerie en position verticale. La première étape pour prendre en sandwich les embryons est de faire une litière fine gelée de glycérine sur une diapositive. Ensuite, les embryons sont soigneusement alignées sur cette surface et recouvert d&#39;une seconde couche de gelée. Après la seconde couche est solidifiée, les bandes sont découpées de gelée et déplacé verticalement pour l&#39;imagerie. Alternatives sont décrites pour la visualisation des embryons en fonction du type de microscope reposer à être utilisé. Étant donné que toutes les cellules le long de l&#39;axe dorso-ventrale sont imagés à l&#39;intérieur d&#39;un seul foyer commun Z-plan, notre méthode permet une mesure précise et la comparaison des signaux fluorescents ou sans photoblanchiment lumière de diffusion commun à des reconstructions 3D d&#39;embryons monté longitudinalement.

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Upright Imaging of Drosophila Embryos

Nous présentons ici un protocole de montage pour teinté<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons dans une position verticale qui permet l&#39;imagerie des sections en utilisant la microscopie confocale.

Imagerie verticale de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

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Upright Imaging of Drosophila Embryos

9.2K vues.  Case Western Reserve University. Nous présentons ici un protocole de montage pour teinté Drosophila Embryons dans une position verticale qui permet l'imagerie des sections en utilisant la microscopie confocale.

Vidéo: Upright Imaging of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Préparation des cultures de neurones d&#39;embryons de drosophile Midgastrula scène

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

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Biologie

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La préparation des Drosophile Les embryons destinés à Live-imagerie utilisant le protocole goutte suspendue

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

La récolte et la préparation Drosophile Les embryons destinés à l&#39;enregistrement électrophysiologique et autres procédures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Préparation d&#39;embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Dissection en direct de Drosophile Embryons: méthodes simplifiées pour le dépistage de collections de mutants par immunofluorescence

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo d&#39;embryons de drosophile Centrifugation

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Cultures de cellules primaires à partir Drosophile Embryons Gastrula

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

Interférences ARNi par injection dans les ARNdb Drosophile Embryons

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Changement de forme d&#39;imagerie cellulaire en vie Drosophile Embryons

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolement et purification de la kinésine de Drosophila Embryons

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...