La méthode de détection et la palette de couleurs de cytométrie en flux du TPFS spécifique au virus de l’encéphalite japonaise ont été testées pour fournir une référence pour des études similaires. La démonstration de la procédure sera effectuée par Linlin Zhang et Meng Zhang, deux étudiants de notre laboratoire. Pour commencer, stimulez les PBMC du groupe de stimulation JEV avec des particules JEV inactivées concentrées pendant 16 heures à 37 degrés Celsius en présence d’anticorps monoclonaux, CD28 et CD49d, CD107a, GolgiPlug et monensin.
Ensuite, stimuler les PBMC du groupe témoin sans particules virales concentrées pendant 16 heures à 37 degrés Celsius en présence d’anticorps monoclonaux, CD28 et CD49d, CD 107a, GolgiPlug et monensin. Recueillir la suspension cellulaire de chaque groupe dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Centrifuger à 500 g pendant cinq minutes à température ambiante et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.
Remettez les cellules en suspension dans 1 millilitre de PBS. Ajouter un colorant de viabilité réparable à la suspension cellulaire et incuber pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Centrifuger à 500 g à température ambiante pendant cinq minutes et retirer le surnageant.
Après avoir remis les cellules en suspension dans 1 millilitre de PBS, à nouveau, centrifuger à 500 g à température ambiante pendant cinq minutes et jeter le surnageant comme démontré précédemment. Pour effectuer la coloration des marqueurs de surface cellulaire, remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de PBS et ajoutez deux microlitres de chaque anticorps marqueur de surface à la suspension cellulaire dans chaque tube. Incuber les tubes pendant 30 minutes à température ambiante tout en les protégeant de la lumière.
Centrifuger à 500 g pendant cinq minutes et retirer le surnageant comme démontré précédemment. Encore une fois, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS. Centrifuger à 500 g pendant cinq minutes à température ambiante et jeter soigneusement le surnageant.
Pour effectuer la fixation et la rupture de la membrane, remettez les cellules en suspension avec 500 microlitres de solution fixatrice de rupture de membrane et fixez les cellules pendant 20 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Puis centrifuger à 500 g pendant cinq minutes et retirer le surnageant. Après avoir remis les cellules en suspension dans un millilitre de PBS, centrifuger pendant cinq minutes à 500 g à température ambiante et retirer le surnageant avec précaution, comme démontré précédemment.
Ensuite, remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de PBS et ajoutez deux microlitres de chaque anticorps cytokine à la suspension cellulaire dans chaque tube pour la coloration intracellulaire des cytokines. Incuber les tubes pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Encore une fois, centrifuger à 500 g pendant cinq minutes et retirer le surnageant comme démontré précédemment.
Encore une fois, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS. Centrifuger à 500 g pendant cinq minutes à température ambiante et retirer le surnageant avec précaution comme démontré précédemment. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de PBS pour remettre les cellules en suspension.
Après avoir isolé l’échantillon PBMC seul, comme démontré précédemment, diviser la suspension cellulaire en 12 parties égales dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre décrits dans le manuscrit. De même, après avoir ajouté les marqueurs de surface cellulaire et l’anticorps de cytokine intracellulaire, comme démontré précédemment, ajoutez 500 microlitres de PBS pour remettre en suspension les cellules et le vortex à faible vitesse. À l’aide d’un échantillon non coloré, ajuster la diffusion directe, la diffusion latérale et différentes tensions de colorant fluorescent, tout en ajustant la compensation de cytométrie en flux pour éliminer les signaux de contamination entre les différents fluorophores, en utilisant les échantillons de coloration uniques.
Tracez une porte polygonale à travers la zone de diffusion avant, un diagramme de points de zone de dispersion latérale pour sélectionner la population de lymphocytes intacte, tout en excluant les débris, et une porte rectangulaire à travers la zone de diffusion avant, un diagramme de points de largeur de diffusion avant pour sélectionner les cellules individuelles. Ensuite, tracez une porte rectangulaire à travers le diagramme de points de la zone de dispersion du côté mort pour sélectionner les cellules vivantes, et une porte rectangulaire à travers le diagramme de points de la zone de dispersion latérale CD3 pour identifier les trois cellules T positives du CD. Ensuite, tracez une porte quadruple à travers le diagramme de points CD4, CD8 pour identifier les lymphocytes T CD4 positifs ou CD8 positifs et à travers le diagramme à points CD45RO, CD27 pour subdiviser les lymphocytes T CD4 positifs ou CD8 positifs en MTC et MET.
Après avoir dessiné les portes de CD107a, de l’interféron gamma, du facteur de nécrose tumorale alpha, de l’interleukine 2 et de la protéine inflammatoire microphage un alpha à partir de la MTC ou de la TEM des lymphocytes T CD8 positifs ou CD4 positifs pour déterminer la fréquence des différents modèles de réponse respectivement. Chargez les échantillons sur la cytométrie séquentiellement. La stratégie de contrôle a été utilisée pour identifier la MTC ou la MET des lymphocytes T CD8 positifs ou CD4 positifs et leurs sous-ensembles à l’aide de la largeur de la zone de diffusion avant, puis du diagramme de points de la zone de diffusion latérale.
La caractérisation polyfonctionnelle des réponses des lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs au JEV a indiqué que des niveaux accrus de CD107a, d’interféron gamma, de facteur de nécrose tumorale alpha et d’interleukine 2 ont été détectés dans les cellules TCM CD8 positives des enfants vaccinés après la stimulation par le JEV par rapport à ceux des enfants non vaccinés. Cependant, le niveau de protéine inflammatoire macrophage un alpha ne différait pas entre les deux groupes. Des taux plus élevés de CD107a et d’interféron gamma ont été détectés dans les cellules TEM CD8 positives du groupe vacciné sous stimulation par le JEV par rapport au groupe non vacciné.
Alors que le facteur de nécrose tumorale alpha, l’interleukine 2 et la protéine inflammatoire macrophage un alpha n’étaient pas significativement élevés dans ces cellules positives. L’antigène JEV a induit avec succès des niveaux plus élevés de CD107a, d’interféron gamma, de facteur de nécrose tumorale alpha et de protéine inflammatoire alpha des macrophages dans les cellules TCM CD4 positives du groupe vacciné par rapport au groupe non vacciné. Cependant, la proportion de cellules positives à l’interleukine 2 ne différait pas entre les deux groupes sous stimulation par JEV.
La proportion de sous-ensembles CD107a positifs, positifs à l’interféron gamma et positifs au facteur de nécrose tumorale alpha, de cellules TEM sous-CD4 positives dans le groupe vacciné était plus élevée en présence de JEV que dans le groupe non vacciné. L’immunogénicité des stimuli par les lymphocytes T et les stratégies de correspondance des couleurs compatibles sont des étapes critiques de ce protocole.
