Lorsque nous étudions le vieillissement et les elegans de mer, nous suivons généralement une population d’animaux au fil du temps. Cela nous donne un aperçu de ce que le processus que vous étudiez fait dans la population à chaque point temporel, mais cela ne vous dit pas comment le processus change chez les animaux individuels au fil du temps. Ces environnements de culture animale uniques nous permettent de suivre les changements dynamiques dans les processus moléculaires et les processus physiologiques chez les animaux individuels au fil du temps pour des centaines d’animaux en parallèle.
Nous constatons qu’il y a deux choses majeures qui peuvent vraiment avoir un impact sur la qualité de ces systèmes de culture multi-puits. L’un est soit sur ou sous séchage des puits et le second est la contamination. Et nous essayons de noter tout au long du protocole des étapes spécifiques où vous pouvez essayer d’atténuer ces problèmes.
Emily Gardea fera la démonstration du protocole aujourd’hui. Elle est technicienne dans mon laboratoire et a fait beaucoup de travail pour optimiser ce protocole. Après avoir préparé tous les réactifs, mélanger 60 grammes de base PDMS et six grammes d’agent de durcissement par moule dans un grand bateau jetable à l’aide d’une spatule jetable.
Placez le mélange PDMS dans une chambre à vide pendant 30 minutes à moins 0,08 Mega Pascal pour éliminer les bulles. Versez et remplissez le mélange PDMS dans chaque moule imprimé en 3D. Placez le moule rempli et tout mélange PDMS supplémentaire dans la chambre à vide pendant 25 minutes à moins 0,08 Mega Pascal.
Retirez le moule rempli de la chambre à vide et faites éclater les bulles restantes avec une spatule jetable. En commençant par un bord, abaissez lentement une feuille d’acrylique plate sur le moule rempli de PDMS. Si la formation de bulles se produit, procédez comme décrit dans le manuscrit.
Placez un poids de 2,5 livres sur l’acrylique et placez les moules lestés dans le four. Laissez-les guérir à 55 degrés Celsius pendant la nuit. À la fin de l’incubation, retirez les poids et les moules du four.
Ensuite, travaillez une lame de rasoir entre l’acrylique et le PDMS durci Pour briser le joint À l’aide d’un rasoir ou d’une spatule en métal, desserrez soigneusement les côtés du PDMS durci et retirez-les du moule. Enveloppez le dispositif PDMS dans du papier d’aluminium. Scellez-le avec du ruban d’autoclave et stérilisez-le par autoclavage sur un cycle sec pendant au moins 15 minutes à 121 degrés Celsius et 15 livres par pouce carré pression manométrique.
Pour préparer le dispositif multipuits, préchauffez un incubateur de bain de perles sèches à 90 degrés Celsius. Déballez un appareil multipuits autoclavé et coupez une petite encoche dans le coin supérieur droit de l’appareil. Placez jusqu’à trois appareils non emballés dans le nettoyeur plasma avec les puits orientés vers le haut et faites fonctionner le nettoyeur plasma.
Stérilisez un plateau en polystyrène à puits unique par appareil en pulvérisant l’intérieur du plateau avec de l’éthanol à 70% et en l’essuyant avec une lingette de travail. Retirez chaque appareil du nettoyeur plasma avec une main gantée et placez-le dans un plateau nettoyé. Placez ensuite une bassine à pipette jetable de 25 millilitres dans l’incubateur de bain de perles préchauffé à 90 degrés Celsius.
Prenez un tube de prémélange LMNGM solidifié par dispositif à remplir et placez-le dans un bécher en verre de 200 millilitres. Retirer le capuchon et le parafilm et cuire au micro-ondes jusqu’à ce que le média fonde suffisamment pour verser. Versez le prémélange LMNGM fondu dans un autre bécher stérile de 200 millilitres.
Plusieurs tubes à essai peuvent être combinés dans ce bécher si plus d’un dispositif est rempli à la fois. Micro-ondes le prémélange LMNGM pendant 20 secondes supplémentaires. Si le prémélange commence à bouillir, arrêtez le micro-ondes et laissez-le se déposer.
Retirez le prémélange LMNGM fondu du four à micro-ondes et refroidissez-le à 60 degrés Celsius. Ajouter les ingrédients LMNGM restants au mélange pré-mélangé et verser le LMNGM fondu dans la bassine de 25 millilitres dans le bain de billes. Remplissez les puits de l’appareil à l’aide d’une pipette répétitrice multicanal de 200 microlitres.
Réglez le répéteur pour distribuer des aliquotes de 14 microlitres et montez cinq pointes de pipette. Chargez les embouts avec du LMNGM fondu et distribuez les 14 premiers microlitres dans le bassin contenant LMNGM. En se déplaçant rapidement mais prudemment, distribuez 14 microlitres dans les puits intérieurs de l’appareil et redistribuez le LMNGM restant dans le bassin, car l’aliquote finale est généralement inférieure à 14 microlitres.
Ensuite, réglez le répéteur pour distribuer des aliquotes de 15 microlitres et remplir l’anneau de puits le plus externe. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, distribuez 200 microlitres de solution de sulfate de cuivre dans le fossé de l’appareil dans chaque coin. Évitez de trop remplir les douves et assurez-vous que le sulfate de cuivre ne touche pas la surface supérieure des puits.
Si le sulfate de cuivre ne s’écoule pas facilement dans tout le fossé, utilisez un court pic en fil de platine pour aider à briser la tension et faire glisser le sulfate de cuivre à travers le fossé. Une fois que le sulfate de cuivre a coulé dans tout le fossé, retirez autant de sulfate de cuivre que possible à l’aide d’une pipette de 200 microlitres ou d’une aspiration sous vide. À l’aide d’une bouteille pressée, ajoutez les cristaux d’eau dans les espaces entre l’appareil et les parois du plateau.
Fermez le couvercle du plateau et enveloppez les quatre côtés avec un morceau de Parafilm. Ajoutez deux morceaux de Parafilm supplémentaires pour sceller complètement la plaque. À l’aide d’une pipette répétitrice, repérez chaque puits avec cinq microlitres de bactéries concentrées.
Éviter tout contact direct avec la surface LMNGM. Séchez les appareils à l’aide d’une boîte de séchage sur mesure qui peut être construite à un coût minime à l’aide de ventilateurs de boîtier d’ordinateur et de filtres HEPA. Dans le cadre d’une portée de dissection, inspecter les puits pour s’assurer que tous les puits ont séché avec succès.
À l’aide d’un pic en platine, transférer les animaux des plaques de vers préparées et ajouter un ver par puits. Ajouter une goutte de solution détergente préparée à l’intérieur du couvercle du plateau et frotter avec une lingette de travail jusqu’à ce que la solution de détergent soit sèche. Enveloppez le plateau avec trois morceaux de Parafilm comme décrit dans le manuscrit.
L’extension de la durée de vie de daf-2 (ARNi) est bloquée par la mutation nulle daf-16. La durée de vie et la durée de vie ont également diminué en présence de daf-2 (ARNi)La moyenne mobile de l’activité sur trois jours tout au long de la vie est réduite par le mutant daf-16 et le daf-2 (ARNi)La variation de la durée de vie et de la durée de santé entre les animaux individuels par rapport en termes absolus ou en fraction de la durée de vie totale est indiquée. L’activité cumulative tout au long de la vie des animaux individuels correspond mieux à la durée de vie que l’activité des animaux individuels un jour spécifique de la vie.
Il est important de remplir les puits et d’ajouter les vers le plus rapidement possible. Sinon, les puits peuvent s’assécher et les vers ne survivront pas. Ce système est compatible avec l’imagerie automatisée qui peut être utilisée pour recueillir des données à haut débit telles que la durée de vie, l’activité et la taille ou la forme du corps.
