Yaşlanma ve deniz eleganlarını incelerken, genellikle zaman içinde bir hayvan popülasyonunu takip ediyoruz. Bu bize çalışmakta olduğunuz sürecin her zaman noktasında popülasyonda ne yaptığına dair bir fikir verir, ancak sürecin zaman içinde bireysel hayvanlarda nasıl değiştiğini söylemez. Bu tek hayvan kültürü ortamları, yüzlerce hayvan için zaman içinde bireysel hayvanlardaki moleküler süreçlerdeki ve fizyolojik süreçlerdeki dinamik değişiklikleri paralel olarak takip etmemizi sağlar.
Bu çok kuyulu kültür sistemlerinin kalitesini gerçekten etkileyebilecek iki önemli şey olduğunu görüyoruz. Biri kuyuların kurutulmasının üzerinde veya altında kurutulması, ikincisi ise kontaminasyondur. Ve protokol boyunca, bu sorunları hafifletmeye çalışabileceğiniz belirli adımları not etmeye çalışıyoruz.
Bugün protokolü gösteren Emily Gardea olacak. Laboratuvarımda bir teknisyen ve bu protokolü optimize etmek için çok çalıştı. Tüm reaktifleri hazırladıktan sonra, tek kullanımlık bir spatula kullanarak kalıp başına 60 gram PDMS baz ve altı gram kürleme maddesini tek kullanımlık büyük bir teknede karıştırın.
Kabarcıkları gidermek için PDMS karışımını eksi 0.08 Mega Pascal'da 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin. PDMS karışımını her 3D baskılı kalıba dökün ve doldurun. Doldurulmuş kalıbı ve herhangi bir ekstra PDMS karışımını eksi 0.08 Mega Pascal'da 25 dakika boyunca vakum odasına koyun.
Doldurulmuş kalıbı vakum odasından çıkarın ve kalan kabarcıkları tek kullanımlık bir spatula ile patlatın. Bir kenardan başlayarak, PDMS dolgulu kalıbın üzerine düz bir akrilik tabakayı yavaşça indirin. Kabarcık oluşumu meydana gelirse, makalede açıklandığı gibi devam edin.
Akrilik üzerine 2,5 pound ağırlık verin ve ağırlıklı kalıpları fırına yerleştirin. Bir gecede 55 santigrat derecede iyileşmelerine izin verin. Kuluçkanın sonunda, ağırlıkları ve kalıpları fırından çıkarın.
Daha sonra, akrilik ve kürlenmiş PDMS arasında bir tıraş bıçağı çalışın Contayı kırmak için Bir tıraş bıçağı veya metal bir spatula kullanarak, kürlenmiş PDMS'nin kenarlarını dikkatlice gevşetin ve kalıptan çıkarın. PDMS cihazını alüminyum folyoya sarın. Otoklav bant ile kapatın ve kuru bir döngüde 121 santigrat derece ve inç kare ölçer basıncı başına 15 pound en az 15 dakika boyunca otoklavlayarak sterilize edin.
Çok kuyucuklu cihazı hazırlamak için, kuru bir boncuk banyosu inkübatörünü 90 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Otoklavlanmış çok kuyucuklu bir cihazın ambalajını açın ve cihazın sağ üst köşesindeki küçük bir çentiği kesin. Plazma temizleyiciye, kuyucuklar yukarı bakacak şekilde üç adede kadar ambalajsız cihaz yerleştirin ve plazma temizleyiciyi çalıştırın.
Tepsinin içine% 70 etanol püskürterek ve bir görev mendili ile silerek cihaz başına tek bir kuyucuklu polistiren tepsiyi sterilize edin. Her cihazı eldivenli bir elinizle plazma temizleyiciden çıkarın ve temizlenmiş bir tepsiye yerleştirin. Ardından, 90 santigrat derecede önceden ısıtılmış boncuk banyosu inkübatörüne 25 mililitrelik tek kullanımlık bir pipet havuzu yerleştirin.
Doldurulacak cihaz başına bir tüp katılaşmış LMNGM ön karışımı alın ve 200 mililitrelik bir cam beher içine yerleştirin. Kapağı, Parafilmi ve mikrodalgayı, ortam dökülecek kadar eriyene kadar çıkarın. Erimiş LMNGM ön karışımını başka bir steril 200 mililitrelik beher içine dökün.
Aynı anda birden fazla cihaz doldurulursa, bu beherde birden fazla test tüpü birleştirilebilir. LMNGM ön karışımını 20 saniye daha mikrodalgada pişirin. Ön karışım kaynamaya başlarsa, mikrodalgayı durdurun ve yerleşmesine izin verin.
Erimiş LMNGM ön karışımını mikrodalgadan çıkarın ve 60 santigrat dereceye kadar soğutun. Kalan LMNGM bileşenlerini ön karışıma ekleyin ve erimiş LMNGM'yi boncuk banyosundaki 25 mililitrelik havzaya dökün. 200 mikrolitrelik çok kanallı tekrarlayıcı pipet kullanarak cihaz kutularını doldurun.
Tekrarlayıcıyı 14 mikrolitrelik alikotları dağıtacak şekilde ayarlayın ve beş pipet ucu takın. Uçları erimiş LMNGM ile yükleyin ve ilk 14 mikrolitreyi LMNGM içeren havzaya geri dağıtın. Hızlı ama dikkatli bir şekilde hareket ederek, cihazın iç kuyucuklarına 14 mikrolitre dağıtın ve kalan LMNGM'yi havzaya geri dağıtın, çünkü son aliquot tipik olarak 14 mikrolitreden azdır.
Daha sonra, tekrarlayıcıyı 15 mikrolitrelik alikotları dağıtacak ve en dıştaki kuyucuk halkasını dolduracak şekilde ayarlayın. 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, her köşedeki cihaz hendeğine 200 mikrolitre bakır sülfat çözeltisi dağıtın. Hendeğin aşırı doldurulmasından kaçının ve bakır sülfatın kuyucukların üst yüzeyine temas etmediğinden emin olun.
Bakır sülfat tüm hendek boyunca kolayca akmazsa, gerginliği kırmaya yardımcı olmak ve bakır sülfatı hendek boyunca sürüklemek için kısa bir platin tel çekme kullanın. Bakır sülfat tüm hendek boyunca aktıktan sonra, 200 mikrolitrelik bir pipet veya vakumlu aspirasyon kullanarak mümkün olduğunca fazla bakır sülfat çıkarın. Bir sıkma şişesi kullanarak, su kristallerini cihaz ile tepsi duvarları arasındaki boşluklara ekleyin.
Tepsi kapağını kapatın ve dört tarafı da bir parça Parafilm ile sarın. Plakayı tamamen kapatmak için iki ek Parafilm parçası ekleyin. Bir tekrarlayıcı pipet kullanarak, her bir kuyucuğu beş mikrolitre konsantre bakteri ile tespit edin.
LMNGM yüzeyiyle doğrudan temastan kaçının. Bilgisayar kasası fanları ve HEPA filtreleri kullanılarak minimum maliyetle inşa edilebilen özel yapım bir kurutma kutusu kullanarak cihazları kurutun. Bir diseksiyon kapsamı altında, tüm kuyuların başarıyla kuruduğundan emin olmak için kuyuları inceleyin.
Bir platin toplama kullanarak, hayvanları hazırlanan solucan plakalarından aktarın ve kuyucuk başına bir solucan ekleyin. Tepsi kapağının içine bir damla hazırlanmış deterjan çözeltisi ekleyin ve deterjan çözeltisi kuruyana kadar bir görev mendili ile ovalayın. Tepsiyi el yazmasında açıklandığı gibi üç parça Parafilm ile sarın.
Daf-2'nin (RNAi) yaşam süresi uzaması, daf-16 null mutasyonu tarafından bloke edilir. Sağlık süresi de daf-2 (RNAi) varlığında azaldı Yaşam süresi boyunca üç günlük yuvarlanma aktivitesi ortalaması daf-16 mutant ve daf-2 (RNAi) tarafından azaltıldı.Bireysel hayvanlar arasında yaşam süresi ve sağlık süresindeki varyasyon, mutlak terimlerle veya toplam ömrün bir kısmı olarak karşılaştırıldığında gösterilmiştir. Bireysel hayvanlar için yaşam süresi boyunca kümülatif aktivite, yaşam süresi boyunca belirli bir günde bireysel hayvanlar için aktiviteden daha iyi bir şekilde ilişkilidir.
Kuyucukları doldurmak ve solucanları mümkün olduğunca çabuk eklemek önemlidir. Aksi takdirde kuyular kuruyabilir ve solucanlar hayatta kalamaz. Bu sistem, kullanım ömrü, aktivite ve vücut büyüklüğü veya şekli gibi yüksek verimli verileri toplamak için kullanılabilen otomatik görüntüleme ile uyumludur.
