عندما ندرس الشيخوخة و elegans البحر ، فإننا عادة ما نتابع مجموعة من الحيوانات بمرور الوقت. هذا يعطينا لمحة عما تفعله هذه العملية التي تدرسها في السكان في كل نقطة زمنية ولكنها لا تخبرك كيف تتغير العملية في الحيوانات الفردية بمرور الوقت. تسمح لنا بيئات الاستزراع الحيواني الفردية هذه بمتابعة التغيرات الديناميكية في العمليات الجزيئية والعمليات الفسيولوجية في الحيوانات الفردية بمرور الوقت لمئات الحيوانات بالتوازي.
نجد أن هناك شيئين رئيسيين يمكن أن يؤثرا حقا على جودة أنظمة الاستزراع متعددة الآبار هذه. أحدهما إما فوق أو تحت تجفيف الآبار والثاني هو التلوث. ونحاول أن نلاحظ في جميع أنحاء البروتوكول خطوات محددة حيث يمكنك محاولة التخفيف من هذه المشاكل.
إظهار البروتوكول اليوم سيكون إميلي غارديا. إنها فنية في مختبري وقد قامت بالكثير من العمل لتحسين هذا البروتوكول. بعد تحضير جميع الكواشف ، امزج 60 جراما من قاعدة PDMS وستة جرامات من عامل المعالجة لكل قالب في قارب كبير يمكن التخلص منه باستخدام ملعقة يمكن التخلص منها.
ضع خليط PDMS في غرفة مفرغة لمدة 30 دقيقة عند سالب 0.08 ميجا باسكال لإزالة الفقاعات. صب وملء خليط PDMS في كل قالب مطبوع 3D. ضع القالب المملوء وأي خليط PDMS إضافي في غرفة التفريغ لمدة 25 دقيقة عند سالب 0.08 ميجا باسكال.
قم بإزالة القالب المملوء من غرفة التفريغ وقم بفرقعة أي فقاعات متبقية باستخدام ملعقة يمكن التخلص منها. بدءا من حافة واحدة ، قم بخفض لوح أكريليك مسطح ببطء أعلى القالب المملوء PDMS. في حالة حدوث تكوين الفقاعة ، تابع كما هو موضح في المخطوطة.
ضع وزنا 2.5 رطل على الأكريليك وضع القوالب المرجحة في الفرن. دعهم يشفون عند 55 درجة مئوية طوال الليل. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة الأوزان والقوالب من الفرن.
بعد ذلك ، اعمل شفرة حلاقة بين الأكريليك و PDMS المعالج لكسر الختم باستخدام ماكينة حلاقة أو ملعقة معدنية ، قم بفك جوانب PDMS المعالجة بعناية وإزالتها من القالب. لف جهاز PDMS بورق الألمنيوم. أغلقه بشريط الأوتوكلاف وقم بتعقيمه عن طريق التعقيم في دورة جافة لمدة 15 دقيقة على الأقل عند 121 درجة مئوية و 15 رطلا لكل بوصة مربعة من ضغط القياس.
لتحضير الجهاز متعدد الآبار ، سخن حاضنة حمام حبة جافة إلى 90 درجة مئوية. قم بفك غلاف جهاز متعدد الآبار معقم وقطع درجة صغيرة في الزاوية اليمنى العليا من الجهاز. ضع ما يصل إلى ثلاثة أجهزة غير مغلفة في منظف البلازما مع توجيه الآبار لأعلى وقم بتشغيل منظف البلازما.
قم بتعقيم صينية بوليسترين بئر واحدة لكل جهاز عن طريق رش الجزء الداخلي من الدرج بنسبة 70٪ من الإيثانول ومسحه حتى يجف بمسح المهام. أخرج كل جهاز من منظف البلازما بيد قفاز وضعه في صينية نظيفة. ثم ضع حوض ماصة سعة 25 ملليلتر يمكن التخلص منه في حاضنة حمام حبة مسخنة مسبقا عند 90 درجة مئوية.
خذ أنبوبا واحدا من خليط LMNGM المتصلب مسبقا لكل جهاز ليتم ملؤه وضعه في دورق زجاجي سعة 200 ملليلتر. قم بإزالة الغطاء و Parafilm والميكروويف حتى تذوب الوسائط بدرجة كافية للصب. صب الخليط المسبق LMNGM المنصهر في دورق معقم آخر سعة 200 ملليلتر.
يمكن دمج أنابيب اختبار متعددة في هذه الكأس الزجاجية إذا تم ملء أكثر من جهاز واحد في المرة الواحدة. ضع الخليط المسبق LMNGM في الميكروويف لمدة 20 ثانية إضافية. إذا بدأ الخليط المسبق في الغليان ، أوقف الميكروويف واتركه يستقر.
أخرج الخليط المنصهر LMNGM مسبقا من الميكروويف وقم بتبريده إلى 60 درجة مئوية. أضف مكونات LMNGM المتبقية إلى خليط الخلط المسبق واسكب LMNGM المنصهر في حوض 25 ملليلتر في حمام الخرز. املأ آبار الجهاز باستخدام ماصة مكرر متعددة القنوات سعة 200 ميكرولتر.
اضبط المكرر لتوزيع حصص 14 ميكرولتر وتركيب خمسة أطراف ماصة. قم بتحميل الأطراف باستخدام LMNGM المنصهر ووزع أول 14 ميكرولترا مرة أخرى في الحوض المحتوي على LMNGM. التحرك بسرعة ولكن بعناية ، قم بتوزيع 14 ميكرولترا في الآبار الداخلية للجهاز وتوزيع LMNGM المتبقي مرة أخرى في الحوض لأن القسمة النهائية عادة ما تكون أقل من 14 ميكرولتر.
بعد ذلك ، اضبط المكرر على توزيع حصص 15 ميكرولتر وملء الحلقة الخارجية للآبار. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من محلول كبريتات النحاس في خندق الجهاز في كل زاوية. تجنب الإفراط في ملء الخندق وتأكد من أن كبريتات النحاس لا تلمس السطح العلوي للآبار.
إذا لم تتدفق كبريتات النحاس بسهولة عبر الخندق بأكمله ، فاستخدم معول سلك بلاتيني قصير للمساعدة في كسر التوتر وسحب كبريتات النحاس عبر الخندق. بعد تدفق كبريتات النحاس عبر الخندق بأكمله ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من كبريتات النحاس باستخدام ماصة 200 ميكرولتر أو شفط مع فراغ. باستخدام زجاجة ضغط ، أضف بلورات الماء في الفراغات بين الجهاز وجدران الدرج.
أغلق غطاء الدرج ولف الجوانب الأربعة بقطعة من Parafilm. أضف قطعتين إضافيتين من Parafilm لإغلاق اللوحة تماما. باستخدام ماصة مكرر ، اكتشف كل بئر بخمسة ميكرولترات من البكتيريا المركزة.
تجنب الاتصال المباشر بسطح LMNGM. جفف الأجهزة باستخدام صندوق تجفيف مصمم خصيصا يمكن بناؤه بأقل تكلفة باستخدام مراوح علبة الكمبيوتر ومرشحات HEPA. تحت نطاق التشريح ، افحص الآبار للتأكد من أن جميع الآبار قد جفت بنجاح.
باستخدام اختيار البلاتين ، انقل الحيوانات من ألواح الدودة المعدة وأضف دودة واحدة لكل بئر. أضف قطرة من محلول المنظف المحضر إلى داخل غطاء الدرج وافركه بمسح المهمة حتى يجف محلول المنظف. لف الصينية بثلاث قطع من Parafilm كما هو موضح في المخطوطة.
يتم حظر امتداد العمر من daf-2 (RNAi) بواسطة طفرة daf-16 null. انخفض العمر الصحي أيضا في وجود daf-2 (RNAi) يتم تقليل متوسط النشاط المتداول لمدة ثلاثة أيام عبر العمر بواسطة daf-16 mutant و daf-2 (RNAi) يظهر التباين في العمر والعمر الصحي عبر الحيوانات الفردية مقارنة إما من حيث القيمة المطلقة أو كجزء من إجمالي العمر. يرتبط النشاط التراكمي عبر العمر للحيوانات الفردية بشكل أفضل بالعمر من نشاط الحيوانات الفردية في أي يوم محدد عبر العمر.
من المهم ملء الآبار وإضافة الديدان في أسرع وقت ممكن. وإلا يمكن أن تجف الآبار ولن تنجو الديدان. هذا النظام متوافق مع التصوير الآلي الذي يمكن استخدامه لجمع بيانات عالية الإنتاجية مثل العمر والنشاط وحجم الجسم أو شكله.
