Cuando estudiamos el envejecimiento y los elegans marinos, generalmente seguimos una población de animales a lo largo del tiempo. Esto nos da una idea de lo que ese proceso que estás estudiando está haciendo en la población en cada punto de tiempo, pero no te dice cómo está cambiando el proceso en animales individuales a lo largo del tiempo. Estos entornos de cultivo animal individuales nos permiten seguir los cambios dinámicos en los procesos moleculares y los procesos fisiológicos en animales individuales a lo largo del tiempo para cientos de animales en paralelo.
Encontramos que hay dos cosas principales que realmente pueden afectar la calidad de estos sistemas de cultivo de múltiples pozos. Uno es el secado excesivo o insuficiente de los pozos y el segundo es la contaminación. Y tratamos de anotar a lo largo del protocolo pasos específicos donde puede intentar mitigar estos problemas.
Demostrando el protocolo hoy estará Emily Gardea. Ella es una técnica en mi laboratorio y ha trabajado mucho para optimizar este protocolo. Después de preparar todos los reactivos, mezcle 60 gramos de PDMS base y seis gramos de agente de curado por molde en un bote grande desechable utilizando una espátula desechable.
Coloque la mezcla PDMS en una cámara de vacío durante 30 minutos a menos 0,08 Mega Pascal para eliminar las burbujas. Vierta y rellene la mezcla PDMS en cada molde impreso en 3D. Coloque el molde lleno y cualquier mezcla adicional de PDMS en la cámara de vacío durante 25 minutos a menos 0.08 Mega Pascal.
Retire el molde lleno de la cámara de vacío y haga estallar las burbujas restantes con una espátula desechable. Comenzando con un borde, baje lentamente una lámina acrílica plana sobre el molde relleno de PDMS. Si se produce la formación de burbujas, proceda como se describe en el manuscrito.
Coloque un peso de 2.5 libras en el acrílico y coloque los moldes pesados en el horno. Déjelos curar a 55 grados centígrados durante la noche. Al final de la incubación, retire los pesos y los moldes del horno.
A continuación, trabaje una cuchilla de afeitar entre el acrílico y el PDMS curado Para romper el sello Con una navaja de afeitar o una espátula de metal, afloje con cuidado los lados del PDMS curado y retírelos del molde. Envuelva el dispositivo PDMS en papel de aluminio. Séllelo con cinta de autoclave y esterilícelo en autoclave en un ciclo seco durante al menos 15 minutos a 121 grados centígrados y 15 libras por pulgada cuadrada de presión manométrica.
Para preparar el dispositivo de pocillos múltiples, precaliente una incubadora de baño de perlas secas a 90 grados centígrados. Desenvuelva un dispositivo multipocillo esterilizado en autoclave y corte una pequeña muesca en la esquina superior derecha del dispositivo. Coloque hasta tres dispositivos sin envolver en el limpiador de plasma con los pocillos hacia arriba y haga funcionar el limpiador de plasma.
Esterilice una bandeja de poliestireno de un solo pozo por dispositivo rociando el interior de la bandeja con etanol al 70% y secándola con una toallita de tareas. Retire cada dispositivo del limpiador de plasma con una mano enguantada y colóquelo en una bandeja limpia. Luego coloque un recipiente de pipeta desechable de 25 mililitros en la incubadora de baño de perlas precalentada a 90 grados centígrados.
Tome un tubo de premezcla LMNGM solidificada por dispositivo para llenarlo y colóquelo en un vaso de precipitados de vidrio de 200 mililitros. Retire la tapa y el Parafilm y el microondas hasta que el medio se derrita lo suficiente como para verter. Vierta la premezcla LMNGM fundida en otro vaso estéril de precipitados de 200 mililitros.
Se pueden combinar múltiples tubos de ensayo en este vaso de precipitados si se llena más de un dispositivo a la vez. Calienta en el microondas la premezcla LMNGM durante 20 segundos adicionales. Si la premezcla comienza a hervir, detenga el microondas y deje que se asiente.
Retire la premezcla LMNGM fundida del microondas y enfríela a 60 grados centígrados. Agregue los ingredientes restantes de LMNGM a la mezcla previa a la mezcla y vierta el LMNGM fundido en el recipiente de 25 mililitros en el baño de cuentas. Llene los pocillos del dispositivo con una pipeta repetidora multicanal de 200 microlitros.
Ajuste el repetidor para dispensar alícuotas de 14 microlitros y monte cinco puntas de pipeta. Cargue las puntas con LMNGM fundido y dispense los primeros 14 microlitros de nuevo en el recipiente que contiene LMNGM. Moviéndose rápida pero cuidadosamente, dispense 14 microlitros en los pocillos internos del dispositivo y dispense el LMNGM restante de nuevo en el recipiente, ya que la alícuota final suele ser inferior a 14 microlitros.
A continuación, configure el repetidor para dispensar alícuotas de 15 microlitros y llenar el anillo más externo de pozos. Usando una pipeta de 200 microlitros, dispense 200 microlitros de solución de sulfato de cobre en el foso del dispositivo en cada esquina. Evite llenar demasiado el foso y asegúrese de que el sulfato de cobre no toque la superficie superior de los pozos.
Si el sulfato de cobre no fluye fácilmente a través de todo el foso, use un pico corto de alambre de platino para ayudar a romper la tensión y arrastre el sulfato de cobre a través del foso. Después de que el sulfato de cobre haya fluido a través de todo el foso, retire la mayor cantidad posible de sulfato de cobre usando una pipeta de 200 microlitros o aspiración con vacío. Con una botella de presión, agregue los cristales de agua en los espacios entre el dispositivo y las paredes de la bandeja.
Cierre la tapa de la bandeja y envuelva los cuatro lados con un trozo de Parafilm. Agregue dos piezas adicionales de Parafilm para sellar la placa por completo. Usando una pipeta repetidora, localice cada pocillo con cinco microlitros de bacterias concentradas.
Evite el contacto directo con la superficie LMNGM. Seque los dispositivos utilizando una caja de secado hecha a medida que se puede construir a un costo mínimo utilizando ventiladores de caja de computadora y filtros HEPA. Bajo un alcance de disección, inspeccione los pozos para asegurarse de que todos los pozos se hayan secado correctamente.
Usando una púa de platino, transfiera los animales de las placas de gusanos preparadas y agregue un gusano por pozo. Agregue una gota de solución detergente preparada al interior de la tapa de la bandeja y frote con una toallita de tareas hasta que la solución detergente se haya secado. Envuelva la bandeja con tres piezas de Parafilm como se describe en el manuscrito.
La extensión de la vida útil de daf-2 (RNAi) está bloqueada por la mutación nula daf-16. La media móvil de actividad de tres días a lo largo de la vida se reduce por daf-16 mutante y daf-2 (RNAi)Se muestra la variación en la esperanza de vida y la duración de la salud entre animales individuales en comparación con términos absolutos o como una fracción de la vida útil total. La actividad acumulada a lo largo de la vida de los animales individuales se correlaciona mejor con la esperanza de vida que la actividad de los animales individuales en un día específico a lo largo de la vida.
Es importante llenar los pozos y agregar los gusanos lo más rápido posible. De lo contrario, los pozos pueden secarse y los gusanos no sobrevivirán. Este sistema es compatible con imágenes automatizadas que se pueden utilizar para recopilar datos de alto rendimiento, como la vida útil, la actividad y el tamaño o la forma del cuerpo.
