Когда мы изучаем старение и морских элеганов, мы, как правило, следим за популяцией животных с течением времени. Это дает нам представление о том, что этот процесс, который вы изучаете, происходит в популяции в каждый момент времени, но это не говорит вам, как этот процесс меняется у отдельных животных с течением времени. Эти единые среды культивирования животных позволяют нам параллельно отслеживать динамические изменения молекулярных процессов и физиологических процессов у отдельных животных с течением времени для сотен животных.
Мы обнаружили, что есть две основные вещи, которые действительно могут повлиять на качество этих многолуночных культурных систем. Один из них либо пересушивает, либо недосушивает колодцы, а второй - загрязнение. И мы стараемся отмечать в протоколе конкретные шаги, на которых вы можете попытаться смягчить эти проблемы.
Демонстрировать протокол сегодня будет Эмили Гардеа. Она техник в моей лаборатории и проделала большую работу по оптимизации этого протокола. После приготовления всех реагентов смешайте 60 граммов основы PDMS и шесть граммов отвердителя на форму в большой одноразовой лодке с помощью одноразового шпателя.
Поместите смесь PDMS в вакуумную камеру на 30 минут при температуре минус 0,08 мегапаскаля, чтобы удалить пузырьки. Налейте и залейте смесь PDMS в каждую форму, напечатанную на 3D-принтере. Поместите заполненную форму и любую дополнительную смесь PDMS в вакуумную камеру на 25 минут при температуре минус 0,08 мегапаскаля.
Извлеките заполненную форму из вакуумной камеры и лопните оставшиеся пузырьки одноразовым шпателем. Начиная с одного края, медленно опустите плоский акриловый лист поверх формы, заполненной PDMS. Если происходит образование пузырьков, действуйте, как описано в рукописи.
Поместите груз весом 2.5 фунта на акрил и поместите утяжеленные формы в духовку. Дайте им застыть при 55 градусах Цельсия за ночь. По окончании инкубации достаньте гири и формочки из духовки.
Затем проведите бритвенным лезвием между акрилом и отвержденным PDMS. Чтобы сломать уплотнение С помощью бритвы или металлического шпателя осторожно ослабьте боковые стороны отвержденного PDMS и извлеките их из формы. Оберните устройство PDMS в алюминиевую фольгу. Запечатайте его автоклавной лентой и стерилизуйте, автоклавируя в сухом цикле не менее 15 минут при температуре 121 градус Цельсия и манометрическом давлении 15 фунтов на квадратный дюйм.
Чтобы приготовить многолуночное устройство, разогрейте инкубатор для ванны с сухим бисером до 90 градусов Цельсия. Разверните автоклавное многолуночное устройство и вырежьте небольшую выемку в правом верхнем углу устройства. Поместите до трех неупакованных устройств в плазменный очиститель лунками вверх и запустите плазменный очиститель.
Стерилизуйте один лоток из полистирола на одно устройство, распылив внутри лотка 70% этанола и вытерев его насухо рабочей салфеткой. Извлеките каждое устройство из плазменного очистителя рукой в перчатке и поместите его в очищенный лоток. Затем поместите 25-миллилитровый одноразовый таз для пипеток в инкубатор для ванны с шариками, предварительно нагретый до 90 градусов по Цельсию.
Возьмите одну пробирку затвердевшей предварительной смеси LMNGM на каждое заполняемое устройство и поместите ее в стеклянный стакан объемом 200 миллилитров. Снимите крышку и парапленку и разогрейте в микроволновой печи, пока носитель не расплавится настолько, чтобы его можно было вылить. Перелейте расплавленную предварительную смесь LMNGM в другой стерильный стакан объемом 200 миллилитров.
Несколько пробирок могут быть объединены в этом стакане, если одновременно заполнено более одного устройства. Разогрейте в микроволновой печи предварительную смесь LMNGM еще 20 секунд. Если предварительная смесь начинает закипать, остановите микроволновую печь и дайте ей отстояться.
Извлеките расплавленную предварительную смесь LMNGM из микроволновой печи и охладите ее до 60 градусов Цельсия. Добавьте оставшиеся ингредиенты LMNGM в смесь для предварительной смеси и вылейте расплавленный LMNGM в 25-миллилитровый таз в ванне для шариков. Заполните лунки устройства с помощью многоканальной пипетки-ретранслятора объемом 200 микролитров.
Настройте ретранслятор на дозирование аликвот объемом 14 микролитров и установите пять наконечников пипетки. Загрузите наконечники расплавленным LMNGM и выдайте первые 14 микролитров обратно в бассейн, содержащий LMNGM. Двигаясь быстро, но осторожно, распределите 14 микролитров во внутренние лунки устройства и распределите оставшийся LMNGM обратно в бассейн, поскольку конечная аликвота обычно составляет менее 14 микролитров.
Затем установите ретранслятор на выдачу аликвот объемом 15 микролитров и заполните самое внешнее кольцо лунок. С помощью пипетки объемом 200 микролитров дозируйте 200 микролитров раствора медного купороса в ров устройства в каждом углу. Избегайте переполнения рва и следите за тем, чтобы медный купорос не касался верхней поверхности лунок.
Если медный купорос не проходит легко через весь ров, используйте короткую платиновую проволоку, чтобы снять натяжение и протащить медный купорос через ров. После того, как медный купорос потечет по всему рву, удалите как можно больше медного купороса с помощью пипетки объемом 200 микролитров или аспирации вакуумом. Используя бутылку для выжимки, добавьте кристаллы воды в промежутки между устройством и стенками лотка.
Закройте крышку лотка и оберните все четыре стороны куском парапленки. Добавьте два дополнительных кусочка Parafilm, чтобы полностью запечатать пластину. Используя пипетку-ретранслятор, найдите в каждой лунке пять микролитров концентрированных бактерий.
Избегайте прямого контакта с поверхностью LMNGM. Высушите устройства с помощью специально изготовленной сушильной камеры, которая может быть изготовлена с минимальными затратами с использованием компьютерных корпусных вентиляторов и фильтров HEPA. Под микроскопом вскрытия осмотрите скважины, чтобы убедиться, что все скважины успешно высохли.
Используя платиновую кирку, переложите животных из подготовленных червячных пластин и добавьте по одному червяку в лунку. Добавьте каплю приготовленного раствора моющего средства на внутреннюю часть крышки лотка и протрите рабочей салфеткой, пока раствор моющего средства не высохнет. Оберните поднос тремя кусочками парапленки, как описано в рукописи.
Продление продолжительности жизни daf-2 (RNAi) блокируется нулевой мутацией daf-16. Продолжительность здоровья также уменьшилась в присутствии daf-2 (RNAi)Трехдневное скользящее среднее значение активности на протяжении всей жизни уменьшается за счет мутанта daf-16 и daf-2 (RNAi)Показаны различия в продолжительности жизни и продолжительности здоровья у отдельных животных, сравниваемые либо в абсолютном выражении, либо в виде доли от общей продолжительности жизни. Кумулятивная активность на протяжении всей жизни отдельных животных лучше коррелирует с продолжительностью жизни, чем активность отдельных животных в любой конкретный день на протяжении всей жизни.
Важно как можно быстрее заполнить лунки и добавить червей. В противном случае колодцы могут пересохнуть, и черви не выживут. Эта система совместима с автоматизированной визуализацией, которую можно использовать для сбора данных с высокой пропускной способностью, таких как продолжительность жизни, активность, размер или форма тела.
