私たちが老化と海のエレガンスを研究しているとき、私たちは通常、時間の経過に伴う動物の集団を追跡しています。これにより、あなたが研究しているプロセスが各時点で集団で何をしているのかを垣間見ることができますが、個々の動物でプロセスが時間の経過とともにどのように変化しているかはわかりません。これらの単一動物培養環境により、数百匹の動物について、個々の動物の分子プロセスと生理学的プロセスの動的な変化を経時的に追跡することができます。
これらのマルチウェル培養システムの品質に大きく影響する可能性のある2つの主要な要因があることがわかりました。1つはウェルの乾燥が過剰または不足しており、もう1つは汚染です。また、プロトコル全体を通して、これらの問題を軽減することができる特定の手順に注意するように努めています。
今日のプロトコルのデモンストレーションはエミリーガルデアです。彼女は私の研究室の技術者であり、このプロトコルを最適化するために多くの作業を行ってきました。すべての試薬を調製した後、使い捨てヘラを使用して、型ごとに60グラムのPDMSベースと6グラムの硬化剤を大型の使い捨てウェイボートで混合します。
PDMS混合物をマイナス0.08メガパスカルで30分間真空チャンバーに入れて気泡を除去します。PDMS混合物を各3Dプリントされた型に注ぎ、充填します。充填した金型と余分なPDMS混合物を真空チャンバーにマイナス0.08メガパスカルで25分間入れます。
充填された型を真空チャンバーから取り出し、使い捨てヘラで残りの気泡をポップします。一方の端から始めて、PDMSで満たされた金型の上に平らなアクリルシートをゆっくりと下げます。気泡形成が生じた場合は、原稿に記載のように進行する。
アクリルに2.5ポンドの重りを置き、加重型をオーブンに入れます。摂氏55度で一晩硬化させます。インキュベーションの終わりに、オーブンから重りと型を取り除きます。
次に、アクリルと硬化PDMSの間にかみそりの刃を動かしてシールを破りますかみそりまたは金属ヘラを使用して、硬化したPDMSの側面を慎重に緩め、金型から取り外します。PDMSデバイスをアルミホイルで包みます。オートクレーブテープで密封し、摂氏121度、ゲージ圧15ポンド/平方インチで少なくとも15分間、ドライサイクルでオートクレーブ滅菌します。
マルチウェル装置を準備するには、ドライビーズバスインキュベーターを摂氏90度に予熱します。オートクレーブ滅菌したマルチウェルデバイスの開梱を行い、デバイスの右上隅にある小さな切り込みを切ります。ウェルを上に向けて、最大3つの包装されていないデバイスをプラズマクリーナーに入れ、プラズマクリーナーを実行します。
トレイの内側に70%エタノールをスプレーし、タスクワイプで拭いて乾かすことにより、デバイスごとに1つのウェルポリスチレントレイを滅菌します。手袋をはめた手でプラズマクリーナーから各デバイスを取り出し、クリーニングしたトレイに置きます。次に、摂氏90度に予熱したビーズバスインキュベーターに25ミリリットルの使い捨てピペット洗面器を置きます。
充填するデバイスごとに固化したLMNGMプレ混合物のチューブを1本取り、200ミリリットルのガラスビーカーに入れます。メディアが注ぐのに十分溶けるまで、キャップとパラフィルムと電子レンジを取り外します。溶融LMNGMプレ混合物を別の滅菌200ミリリットルビーカーに注ぎます。
一度に複数のデバイスが充填されている場合、このビーカーに複数の試験管を組み合わせることができます。LMNGMプレ混合物をさらに20秒間電子レンジで加熱します。予備混合物が沸騰し始めたら、電子レンジを停止し、落ち着かせます。
溶融LMNGMプレ混合物を電子レンジから取り出し、摂氏60度に冷却します。残りのLMNGM成分をプレミックス混合物に加え、溶融LMNGMをビーズバスの25ミリリットルの洗面器に注ぎます。200マイクロリットルのマルチチャンネルリピーターピペットを使用してデバイスウェルを満たします。
14マイクロリットルの分注液にリピーターを設定し、5つのピペットチップを取り付けます。チップに溶融LMNGMをロードし、最初の14マイクロリットルをLMNGMを含む洗面器に戻します。迅速かつ慎重に移動し、14マイクロリットルをデバイスの内側のウェルに分注し、最終的な分注液は通常14マイクロリットル未満であるため、残りのLMNGMを洗面器に戻します。
次に、15マイクロリットルのアリコートを分注し、ウェルの最も外側のリングを満たすようにリピーターを設定します。200マイクロリットルのピペットを使用して、200マイクロリットルの硫酸銅溶液を各コーナーのデバイスの堀に分注します。堀をいっぱいにしないようにし、硫酸銅が井戸の上面に触れないようにしてください。
硫酸銅が堀全体を簡単に流れない場合は、短いプラチナワイヤーピックを使用して張力を破り、硫酸銅を堀に引きずり込みます。硫酸銅が堀全体を流れた後、200マイクロリットルのピペットまたは真空吸引を使用してできるだけ多くの硫酸銅を取り除きます。スクイーズボトルを使用して、デバイスとトレイの壁の間のスペースに水の結晶を追加します。
トレイの蓋を閉め、パラフィルムで四方を包みます。パラフィルムピースを2つ追加して、プレートを完全に密閉します。リピーターピペットを使用して、各ウェルに5マイクロリットルの濃縮細菌を見つけます。
LMNGM表面との直接接触を避けてください。コンピュータケースファンとHEPAフィルターを使用して最小限のコストで構築できるカスタムメイドの乾燥ボックスを使用してデバイスを乾燥させます。解剖スコープで、ウェルを検査して、すべてのウェルが正常に乾燥していることを確認します。
プラチナピックを使用して、準備したワームプレートから動物を移し、ウェルごとに1つのワームを追加します。準備した洗剤溶液をトレイの蓋の内側に一滴加え、洗剤溶液が乾くまでタスクワイプでこすります。原稿に記載されているように、トレイを3枚のパラフィルムで包みます。
daf-2(RNAi)からの寿命延長は、daf-16ヌル変異によってブロックされます。daf-2(RNAi)の存在下でも健康寿命が減少した生涯にわたる活動の3日間の移動平均は、daf-16変異体とdaf-2(RNAi)絶対値または全寿命の一部と比較した個々の動物間の寿命と健康寿命の変動が示されています。個々の動物の生涯にわたる累積活動は、寿命全体の特定の日の個々の動物の活動よりも寿命とよく相関しています。
ウェルをいっぱいにし、ワームをできるだけ早く追加することが重要です。そうしないと、井戸が乾燥し、ワームが生き残れなくなる可能性があります。このシステムは、寿命、活動、体のサイズや形状などの高スループットデータを収集するために使用できる自動イメージングと互換性があります。
