Ce protocole présente le système d’activation SPH CRISPR comme une stratégie alternative aux vecteurs viraux conventionnels pour effectuer des tests de fonction de gain dans les adipocytes. Il permet la surexpression d’un ou de plusieurs gènes endogènes adipocytaires dans l’environnement cellulaire complexe du tissu adipeux en délivrant un ARN guide unique personnalisé à l’aide d’un virus associé à un adéno. Les étapes difficiles de ce protocole sont liées au clonage de l’ARN guide unique et à la production et à l’injection de virus adéno-associés dans le tissu adipeux.
Pour commencer, concevez un ARN guide unique ou un ARNsg pour l’activation de CRISPR à l’aide de chopchop ou de tout autre outil approprié. Concevoir l’ARNg ciblant le gène PRDM16 en utilisant les paramètres suivants:Cibler en tant que PRDM16 dans un Mus musculus en utilisant un CRISPR / Cas9 et pour comme activation. Ajouter des surplombs à l’ARNg pour correspondre au site de restriction Sac1 dans la cerise du squelette vecteur PAAVU6GRNACBHM.
Inclure 5'AGCT 3'où n correspond aux nucléotides. Obtenez la séquence inverse du complément 3'sgRNA à l’aide de l’outil indiqué. Ensuite, pour le recuit des oligonucléotides complémentaires simple brin, ajoutez un microlitre de chaque oligonucléotide simple brin 5' et 3', un microlitre de tampon ligase T4, 0,5 microlitre de polynucléotide kinase T4 et 6,5 microlitres d’eau pour un volume de réaction final de 10 microlitres.
Recuit les oligonucléotides simple brin complémentaires à l’aide d’un thermocycleur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes et à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, suivi d’un taux de réduction progressive de cinq degrés Celsius par minute. Ensuite, pour la ligature des oligonucléotides d’ARNg recuits, ajoutez 25 nanogrammes de cerise plasmidique PAAVU6GRNACBHM à deux microlitres d’oligonucléotides d’ARNg recuits, un microlitre d’enzyme Sac1, deux microlitres de tampon ADN ligase 10X T4, un microlitre d’ADN ligase T4 et de l’eau à un volume de réaction final de 10 microlitres. À l’aide d’un thermocycleur, effectuer la ligature en incubant le mélange réactionnel pendant 15 cycles à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes et 25 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis en maintenant à quatre degrés Celsius.
Ensuite, transformez les cellules DH10B compétentes d’Escherichia coli avec quatre microlitres du produit de ligature par choc thermique à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes et étalez-les sur une plaque de gélose contenant 10 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Confirmez les colonies transformées par réaction en chaîne de la polymérase des colonies ou PCR à l’aide du mélange maître PCR, choisissez la colonie et mélangez-la avec cinq microlitres de mélange maître, 0,1 microlitre d’apprêt universel, 0,1 microlitre d’amorce inverse d’ARNg et cinq microlitres d’eau. Exécutez la PCR en utilisant la dénaturation initiale à 94 degrés Celsius pendant deux minutes, suivie de 35 cycles de dénaturation à 94 degrés Celsius pendant 20 secondes, le recuit pendant 30 secondes à 60 degrés Celsius, l’extension à 72 degrés Celsius pendant 30 secondes et une étape finale d’allongement à 72 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Après PCR, résoudre l’ADN en utilisant l’électrophorèse sur gel d’agarose dans un tampon TAE 0,5X à 90 volts pendant 30 minutes. Soumettez des échantillons positifs pour le séquençage de Sanger à l’aide d’un apprêt universel. Ensuite, purifiez le plasmide d’un clone positif à l’aide d’un kit de purification plasmidique en suivant les instructions du fabricant.
Placez la souris anesthésiée en décubitus dorsal et rasez une petite zone sur les flancs proximal aux articulations de la hanche pour les injections de tissu adipeux blanc inguinal ou les injections IWAT avec un rasoir. Ajouter la crème dépilatoire pendant cinq minutes. Enlevez la crème résiduelle avec de l’eau pour éviter les brûlures de la peau.
Désinfectez la peau en utilisant trois cycles alternés d’application de la solution de povidone iodée sur la peau avec de la gaze propre et de l’alcool à 70%. Ensuite, faites une incision d’un à deux centimètres avec des ciseaux stérilisés dans la zone proximale des articulations et maintenez la peau ouverte à l’aide de forceps pour exposer le dépôt de graisse. Le WAT peut être attaché à la peau des deux côtés en l’étendant depuis le début du dos et vers les testicules.
À l’aide d’une pince, tirez doucement le dépôt de graisse vers le haut à travers l’incision pour vous assurer que l’injection est au bon endroit et à la bonne profondeur. Remplissez la seringue de microlitre avec 2,5 microlitres du virus adéno-associé ou d’un AAV contenant l’ARNg ciblant le gène endogène PRDM16. Insérez délicatement l’aiguille à un angle de 30 à 45 degrés dans l’IWAT.
Répétez l’injection cinq fois à différents endroits du tissu pour infecter de manière homogène l’ensemble du coussinet adipeux IWAT. Placez la souris sur le coussin chauffant jusqu’à ce que la conscience soit retrouvée. Surveillez l’animal toutes les 10 à 15 minutes jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement.
Une fois que l’animal a repris conscience, observez le profilage de la locomotive, qui doit être linéaire et ne présenter aucun signe de détresse ou de douleur. Voir les cellules vasculaires stromales ou SVF dérivées de l’IWAT de souris adipo SPH dans une plaque à 6 puits contenant un milieu DMEM complet pendant une à deux heures, aspirer le milieu, laver le puits deux fois avec du PBS et le remplacer par un milieu frais et complet. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité jusqu’à ce que les cellules atteignent 70-80% de confluence.
Au jour 0, induire la différenciation en traitant les cellules avec le milieu d’induction et après deux jours remplacer le milieu d’induction par le milieu d’entretien. Encore une fois après deux jours, au quatrième jour, remplacez le milieu d’entretien par un nouveau milieu d’entretien pendant 2-3 jours. Changez le milieu d’entretien toutes les 48 heures jusqu’à ce que les préadipocytes soient complètement différenciés en adipocytes.
Observez les adipocytes matures à l’aide de la microscopie optique car les cellules différenciées semblent être chargées de gouttelettes lipidiques. Après avoir cultivé les cellules sur une plaque de culture à 6 puits avec le milieu complet jusqu’à ce que les cellules atteignent 70-80% de confluence, mélanger 5,6 * 10 ^ 10 % 10 génome viral par microlitre d’ARNg PRDM16 porteur d’AAV avec deux millilitres de milieu complet et du bromure d’hexadiméthrine. Transduisez les cellules en remplaçant le milieu complet et en ajoutant le milieu complet contenant AAV.
Incuber les cellules transduites pendant 12 heures à 37 degrés Celsius 95% d’humidité et 5% de dioxyde de carbone. Divisez et voyez les cellules comme décrit pour la prolifération cellulaire et la différenciation en adipocytes beiges. Les images d’immunofluorescence de l’IWAT de souris adipo SPH ont démontré l’expression de dCas9 dans les groupes témoin et PRDM16.
L’expression de PRDM16 induite par SPH a clairement induit une accumulation généralisée d’adipocytes beiges multioculaires dans l’IWAT. De plus, la PCR quantitative a révélé une expression accrue de PRDM16 et du programme de gènes thermogéniques dans le groupe PRDM16 par rapport au groupe témoin. De même, l’analyse in vitro de l’expression génique a confirmé l’expression accrue du gène endogène PRDM16 et des gènes thermogéniques dans le groupe de surexpression PRDM16 par rapport au groupe témoin.
L’expression de PRDM16 induite par SPH a entraîné une consommation d’oxygène basale et maximale plus élevée que celle des cellules témoins. Il est important de noter que les données indiquaient une amélioration de la respiration non couplée dans le groupe PRDM16 par rapport à celle du groupe témoin. Le modèle Adipo SPH convient à l’étude de plusieurs gènes et éléments régulateurs au sein des adipocytes.
Cette méthode ouvre la possibilité d’une compréhension plus profonde de la biologie de la graisse beige.
