Le protocole présenté est une méthode très flexible pour la manipulation du génome dans l’oviducte de souris. Il permet la formation de cellules mutées sporadiquement entourées de cellules non éditées dans un environnement immunocompétent. Ceci est avantageux pour étudier l’initiation du cancer.
Le principal avantage de cette technique est sa grande adaptabilité pour cibler un organe, une zone, une région ou un type de cellule d’intérêt avec des ensembles facilement interchangeables de combinaisons de mutations, le tout sans avoir besoin absolu d’une lignée de souris. Cette méthode peut être facilement adaptée pour une utilisation dans les organes avec la lumière ainsi que le parenchyme d’organe. Pour commencer, tirez un tube capillaire en verre dans une pointe tranchante à l’aide d’un extracteur de micropipette.
À l’aide d’une paire de pinces effilées à pointe ultra fine, coupez l’extrémité pointue du tube capillaire tiré sous un microscope à dissection pour créer une ouverture. Assurez-vous que l’ouverture n’est pas trop grande, car elle endommagerait l’oviducte et empêcherait une injection lente. Ensuite, disposez l’équipement de chirurgie stérile, le microscope, le micromanipulateur et l’électroporateur sur un banc propre et stérile ou à l’intérieur de l’armoire de biosécurité.
Faites chauffer le coussin chauffant sur un disque et placez-le sous une cage propre et entièrement équipée. Versez le PBS 1X stérile dans une boîte de Pétri. À l’aide d’une paire de ciseaux propres, coupez le papier absorbant en carrés d’un centimètre sur un.
Déposez-les dans PBS pour les faire tremper. Ensuite, fixez l’aiguille capillaire tirée au micromanipulateur à pince, stabilisé par un support magnétique. Pipeter deux microlitres de la solution injectable sur une boîte de Petri stérile.
Tout en observant au microscope, prenez lentement un à deux microlitres de la solution d’injection dans l’aiguille de micro-injection à l’aide de la seringue à pression d’air fixée au micromanipulateur. Évitez de prendre des bulles dans l’aiguille. Après avoir anesthésié une souris femelle âgée de six à huit semaines et administré du carprofène par voie sous-cutanée, placez la souris sur le papier absorbant chauffé avec la face dorsale vers le haut.
Appliquez du lubrifiant pour les yeux sur chaque œil pour éviter le dessèchement pendant la chirurgie. Après avoir confirmé l’arrêt anesthésique en pinçant l’orteil avec une paire de forceps, retirez la fourrure dorsale autour du site d’incision potentiel et essuyez la peau nue avec un antiseptique. Utilisez une paire de pinces droites et émoussées pour pincer la peau nue et créer une incision d’un centimètre de long le long de la ligne médiane du corps à l’aide d’une paire de ciseaux stériles.
Pincez et maintenez un côté du site de coupe à l’aide d’une paire de pinces Adson stériles. Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces stériles, incurvées et dentelées, séparez doucement la peau de la paroi du corps, en commençant par l’incision médiane et en vous déplaçant latéralement. Après avoir localisé le coussinet adipeux sous le rein, utilisez une paire de pinces stériles, droites et émoussées pour pincer la paroi du corps directement au-dessus du coussinet adipeux.
Créez une petite incision dans la paroi du corps à l’aide d’une paire de ciseaux à dissection stériles, tranchants et pointus, en prenant soin d’éviter les vaisseaux sanguins. Tout en pinçant la paroi du corps avec une pince droite et émoussée, insérez une paire de pinces stériles, émoussées et incurvées dans l’incision et élargissez l’incision créée dans la paroi du corps. Saisissez le coussinet graisseux visible avec la pince émoussée et incurvée et sortez-le du trou pour exposer l’ovaire, l’oviducte et l’utérus.
Gardez la piste de reproduction exposée en serrant le coussinet graisseux avec une pince stérile bulldog. Placez soigneusement la souris anesthésiée avec la piste de reproduction exposée sur la scène d’un microscope à dissection. Ajustez le micromanipulateur de manière à ce que l’aiguille d’injection avec la solution soit observée au microscope.
Ensuite, manipulez le microscope pour observer facilement l’ovaire, l’oviducte et l’utérus. À l’aide d’une paire de pinces stériles, effilées et à pointe ultra fine, maintenez la région de l’oviducte à injecter. La région doit s’aligner sur la direction de l’aiguille de micro-injection.
Ajustez le micromanipulateur pour percer l’oviducte avec l’aiguille de micro-injection, tout en alimentant simultanément l’oviducte sur l’aiguille à l’aide de la pince effilée à pointe ultra fine. Déplacez doucement l’aiguille de micro-injection pour confirmer qu’elle a bien été insérée dans l’oviducte. Injectez lentement un microlitre de la solution d’injection et du bleu de trypan filtré à 5% dans l’oviducte, tout en observant le mouvement de la solution bleue et l’expansion de la lumière oviductique.
Évitez d’introduire des bulles dans la lumière. Après l’injection, retirez l’aiguille de l’oviducte et couvrez la zone à cibler avec un morceau de papier absorbant pré-trempé dans du PBS. Saisissez le papier pré-trempé et la zone à cibler avec une pince à épiler et éloignez-vous du corps.
Électroportez la région cible à l’aide de trois impulsions unipolaires à 30 volts pendant 50 millisecondes à intervalles d’une seconde. Après l’électroporation, retirez le papier absorbant et replacez la souris sur le coussin chauffant. Détachez la pince du bouledogue et repoussez soigneusement la piste de reproduction exposée sous la paroi du corps.
Une fois que les deux oviductes ont été électropolisés et replacés sous la paroi du corps, utilisez un porte-aiguille pour saisir l’aiguille. Pincez et maintenez un côté du site de coupe à l’aide d’une paire de pinces stériles, incurvées et dentelées. Ensuite, utilisez le porte-aiguille pour manipuler la suture et fermer la plaie.
Déplacez la souris dans une cage propre placée sur un coussin chauffant et surveillez jusqu’à ce que la souris soit active. Lors de l’électroporation à l’aide d’électrodes de type pince à épiler de trois ou un millimètre, la zone ciblée marquée avec TdTomato a été limitée à l’épithélium oviducte distal. Avec des électrodes de type pince à épiler de trois millimètres, une zone beaucoup plus grande des ampoules a été ciblée par rapport à la pointe la plus distale, l’infundibulum, en utilisant des électrodes de type pince à épiler d’un millimètre.
Dans la région ciblée, des cellules électroporées marquées par TdTomato ont été distribuées au hasard parmi des cellules non électroporées. De plus, les cellules électroporées ont été limitées à l’épithélium muqueux et n’ont pas été observées dans la couche stromale ou musculaire sous-jacente. Pour confirmer l’édition du génome médiée par CRISPR, les cellules fluorescentes peuvent être isolées par tri FACS pour l’isolement et le séquençage de l’ADN.
Cela nous permet de quantifier la fréquence des allèles ciblés et de suivre les communications uniques entre les échantillons pour suivre l’évolution coronale in vivo de la tumeur primaire et des métastases dans un environnement immunocompétent.
