Cette méthode pourrait vérifier les ARN guides dans les embryons, tester des questions de développement précoce ou créer des souris éditées. Toutes les avancées de CRISPR Cas9 pourraient être utilisées avec cette méthode. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle est facile à apprendre et utilise des réactifs disponibles pour les laboratoires qui ont accès à des souris.
À l’avenir, cette technique serait utile pour corriger une maladie ou une mutation chez la progéniture d’un animal de compagnie ou d’un animal important pour l’agriculture. Cette méthode est la mieux adaptée pour générer des modèles murins. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé des variantes de cette méthode pour étudier les événements entourant la fécondation et le développement préimplantatoire précoce, en particulier la régulation des gènes dans la puissance embryonnaire.
La partie la plus difficile est d’utiliser l’aiguille de verre pour déplacer les embryons d’une assiette à l’autre. Chantal Diallo, spécialiste de la recherche dans mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Pour commencer la collecte et le traitement des embryons, placez la souris femelle euthanasiée sur son dos et vaporisez de l’éthanol à 70% sur l’abdomen pour l’ouvrir chirurgicalement.
Pour ouvrir la cavité abdominale et retirer les oviductes, coupez la couche de peau avec des ciseaux chirurgicaux et localisez les ovaires. Ensuite, retirez chirurgicalement les deux oviductes, situés à proximité des ovaires, et placez-les dans des gouttelettes individuelles de 50 microlitres de milieu M2 plus BSA. Au microscope stéréoscopique, utilisez des pinces à dissection pour entailler l’ampoule de l’oviducte afin de libérer les complexes cumulus-ovocytes ou COC contenant des ovocytes, puis pour éviter le transfert de débris, transférer et combiner chaque cumulus-ovocyte à une seule gouttelette de 50 microlitres de M2 plus BSA avec une pipette à manche réglée à 20 à 30 microlitres.
Ensuite, pour éliminer les cellules cumulus des zygotes, transférer les COC avec un peu de milieu supplémentaire dans une gouttelette de 100 microlitres M2 plus hyaluronidase et mélanger doucement par pipetage jusqu’à ce que les embryons soient visiblement séparés des cellules cumulus beaucoup plus petites. Pour diluer la hyaluronidase et éliminer les cumulus lâches, utilisez une pipette buccale pour déplacer les zygotes vers une nouvelle gouttelette M2 plus BSA de 50 microlitres. Ensuite, pour éroder la zone pellucide de l’embryon et réduire les obstacles physiques supplémentaires à l’administration de réactifs, transférez les embryons dans une gouttelette préchauffée de 100 microlitres d’acide Tyrode, ou solution AT, sur une plaque de 60 millimètres.
Observer en continu les zygotes au microscope stéréoscopique jusqu’à ce que 30% de la zone pellucide soit érodée, puis pour diluer l’AT, faire passer les embryons à travers quatre gouttelettes de 50 microlitres de M2 plus BSA. Ensuite, déterminez un nombre approprié d’embryons qui ont été traités en les comptant au stéréomicroscope. Diluer le BSA en faisant passer les embryons à travers deux gouttelettes de 50 microlitres de milieux sériques réduits.
Ensuite, pipette buccale 25 à 30 embryons dans une gouttelette de 10 microlitres de milieu sérique réduit, puis utilisez une pipette portative pour ajouter 10 microlitres de la ribonucléoprotéine ou du complexe RNP. Diluer le glycérol visqueux du complexe RNP et homogénéiser l’échantillon par pipetage 10 fois ou jusqu’à ce que le mélange ne présente plus de viscosité. Ensuite, pipeter 20 microlitres de mélange d’embryons et de RNP dans une cuvette d’électroporation de 0,1 centimètre tout en évitant les bulles, puis pour délivrer les réactifs d’édition dans le zygote, électroporer les embryons en utilisant un protocole d’ondes carrées de 30 volts, 4 à 6 impulsions avec une longueur d’impulsion de 3 millisecondes et des intervalles d’impulsion de 100.
Ensuite, ajoutez 50 microlitres de M2 plus BSA dans le haut de la cuvette pour rincer les embryons de la cuvette et pipeter doucement ce mélange sur une assiette. Pour la culture d’embryons, transférer 20 à 30 zygotes dans une gouttelette de KSOM plus BSA dans une plaque de culture prééquilibrée et déplacer les embryons vers la gouttelette. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone avec 95% d’humidité.
Le lendemain, ne transférez que des embryons à deux cellules dans une gouttelette fraîche de mélange KSOM plus BSA et remettez la plaque dans l’incubateur. Laissez ou jetez les embryons morts ou non fécondés. Avant le génotypage, laver les embryons de blastocyste morula avec deux gouttes de DPBS pour diluer les composants du milieu qui pourraient interférer avec une réaction de PCR.
À l’aide d’une pipette buccale, transférer les embryons individuels dans un puits d’une bandelette de PCR à 8 puits et ajouter 10 microlitres de tampon de lyse. Ensuite, pour lyser les embryons, programmez un thermocycleur à 55 degrés Celsius pendant 4 heures, puis inactivez la protéinase K avec une incubation de 10 minutes à 95 degrés Celsius. Dans cette étude, un exemple de stratégie visant à cibler le locus tyrosinase de souris en tant que témoin positif, y compris des plans d’oligo et des stratégies de génotypage pour la jonction d’extrémité non homologue et la réparation dirigée par homologie, est présenté.
Lors de l’administration d’un seul guide, ou sgRNA, l’administration de RNP a atteint 100 % inclus dans les souches de souris noires 6J et C57 noires 6N avec formation de délétions d’insertion se produisant à 50 à 100 % et de petits remplacements à base d’oligo allant de 17 à 63 %Lors de l’ingénierie des délétions génomiques, l’efficacité de l’édition varie de 3% à 100%L’embryon doit être maintenu dans des conditions aussi proches que possible des conditions idéales afin que le plus rapidement possible Le protocole est fait, mieux c’est. En outre, minimisez l’exposition à la hyaluronidase et à l’acide Tyrode. Cette méthode décrit la génération d’un animal édité, le test d’implantation ou de viabilité gestationnelle, ou l’exécution de l’expérience plusieurs fois pour collecter des mesures ou des images et divers paramètres pendant le développement pré-plantation.
