L’objectif global de cette procédure est de purifier les ribosomes des mitochondries des lignées cellulaires humaines à grande échelle, ce qui est suffisant pour des études structurelles. Cette méthode de purification ribosome mitochondriale permet la caractérisation des complexes de traduction, des mutants, des assemblages de contrôle de la qualité et des intermédiaires sous-unit mitoribosomal. Ceux-ci peuvent être utilisés pour répondre à des questions clés sur la synthèse des protéines dans les mitochondries.
Le principal avantage de cette technique est que la cavitation de l’azote est utilisée pour la lyse cellulaire et seulement 10 à 10 cellules de culture sont nécessaires pour préparer des mitoribosomes pour la détermination de la structure à haute résolution. Cette technique peut entraîner la découverte de nouveaux composants des machines de traduction des mitochondries et peut être utilisée pour le développement de nouvelles thérapies pour le traitement du cancer. Après avoir culture des cellules HEK293S selon le protocole du texte, récoltez deux tubes de cellules d’un litre par centrifugation à 1000 fois g et quatre degrés Celsius pendant sept minutes.
Décanter soigneusement le supernatant et résuspendre rapidement chaque granulé en 100 millilitres de PBS. Ensuite, mettre les cellules en commun et centrifuger la suspension à 1200 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, après avoir soigneusement décanté le supernatant, peser la pastille.
Ensuite, utilisez 120 millilitres de tampon MIB pour le résuspendre et laisser les cellules résuspendues gonfler dans la chambre froide pendant 20 minutes. Transférer les cellules gonflées dans une chambre de cavitation d’azote pré-refroidie sur la glace. Ensuite, ajoutez 45 millilitres de tampon SM4 aux cellules.
Attachez la chambre de cavitation d’azote et remplissez-la d’azote jusqu’à ce que la pression atteigne 500 PSI. Ensuite, fermez les robinets et gardez-les sur la glace pendant 20 minutes. La méthode de lyse des cellules de cavitation de l’azote prévient le stress physique externe sur les cellules, évite les dommages causés par la chaleur aux organites et le gaz azoté protège les cellules de l’oxydation.
En outre, c’est une méthode hautement reproductible. Relâchez lentement la pression dans la chambre et recueillez le lysate. Ensuite, pour enlever les débris cellulaires et les noyaux, centrifugez le matériau lysé à 800 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Recueillir le supernatant en le versant à travers un morceau plié de tissu de mousseline dans un bécher maintenu sur la glace. Ne jetez pas la pastille. Resuspendez la pastille en 90 millilitres de tampon MiBSM.
Ensuite, à l’aide d’un homogénéisateur en verre téflon, homogénéisez l’échantillon et répétez la centrifugation à 800 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Encore une fois, recueillir le surnatant en le versant à travers un morceau plié de tissu de mousseline dans un bécher conservé sur la glace. Ensuite, combinez ce supernatant avec le premier supernatant.
Centrifugez l’échantillon à 1000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, recueillir le surnatant comme avant. Après avoir jeté la pastille, centrifugeuse le supernatant contenant des mitochondries brutes à 10 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.
Lavez soigneusement n’importe quelle pastille lâche sans déranger la partie serrée. Ensuite, utilisez 10 millilitres de tampon MiBSM pour réutiliser la pastille serrée. Ajouter 200 unités de DNase sans RNase à l’échantillon pour éliminer l’ADN génomique et faire pivoter le tube sur un rouleau dans la chambre froide pendant 20 minutes pour digérer uniformément l’échantillon.
Centrifugez l’échantillon à 10 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes et utilisez deux millilitres de tampon SEM pour réutiliser la pastille. Chargez toute la suspension mitochondriale sur le dessus du gradient de saccharose. Après avoir fait tourner le gradient selon le protocole de texte, à l’aide d’une pipette de transfert, recueillir soigneusement la bande brune migrant à l’interface de 32% et 60% saccharose.
Ce protocole utilise la cavitation de l’azote pour briser les cellules. Une fois maîtrisé, un isolement à grande échelle de mitochondries hautement pures et intactes peut être fait en neuf heures et peut facilement être modifié et adapté pour différents types et échelles cellulaires. Après avoir décongelé les mitochondries gelées sur la glace, ajouter deux volumes de tampon de lyse à trois millilitres de mitochondries.
Mélanger immédiatement en inversant le tube plusieurs fois. Utilisez un petit homogénéiseur en verre téflon pour aider à la lyse et incuber l’homogénéate sur la glace pendant cinq à dix minutes pour compléter la réaction. Centrifugeuse le lysate à 30 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes pour enlever le matériau insoluble.
Ensuite, recueillir soigneusement le surnatant et jeter la pastille. Répétez la centrifugation pour assurer la clarification du surnatant. Ensuite, recueillir soigneusement le surnatant et jeter la pastille.
Pour chaque millilitre de matériau lysé, préparez un coussin saccharose dans un tube ultra clair TLA-120.2 en ajoutant 0,4 millilitres de coussin saccharose aux tubes. Superposez environ un millilitre de mitochondries lysées sur chaque coussin saccharose, ce qui donne un rapport lysate-coussin de 2,5 pour un. Ensuite, centrifugez l’échantillon dans un rotor TLA-120.2 à 231, 550 fois g et quatre degrés Celsius pendant 45 minutes.
Jetez le supernatant et utilisez 100 microlitres du tampon de resuspension pour rincer le tube et enlever le saccharose résiduel. Resuspendez les granulés et combinez-les dans un total de 100 microlitres de tampon de resuspension. Tout en réutilisant la pastille de coussin, il est essentiel d’effectuer sur la glace pour éviter le chauffage de l’échantillon et aussi pour éviter la mousse de l’échantillon afin d’assurer l’intégrité structurale des ribosomes mitochondriaux.
Vortex l’échantillon à vitesse lente pendant 30 secondes pour dissoudre les agrégats restants et centrifuger les tubes à 17, 949 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Recueillir soigneusement le supernatant et répéter la centrifugation. Après avoir mesuré l’absorption du mitoribosome à L’A260, chargez l’échantillon entier sur un seul tube linéaire de gradient de saccharose.
Centrifugez l’échantillon dans un rotor TLS-55 à 213, 626 fois g et quatre degrés Celsius pendant 120 minutes. Pour fractionner le gradient, perforez le fond du tube et recueillez l’échantillon dans une plaque de 96 puits. La purification du mitoribosome ne devrait pas prendre plus de sept heures pour une quantité suffisante de mitoribosomes.
Comme démontré dans ce gradient discontinu de saccharose, les mitochondries purifiées migrent vers la bande inférieure brune à l’interface de 32-60%. Après la séparation des mitoribosomes des complexes mitochondriques solubles sur un gradient de saccharose, deux populations mitoribosomal principales sont identifiées, le monosome 55S et le grand sous-unité 39S. La présence de la grande fraction de sous-unité suggère que les cellules sont récoltées dans un état de division active.
Ce panneau montre un micrographe avec l’échantillon du pic monsome deux à un grossissement calibré de 1,23 angstroms par pixel. Voici les données après le traitement initial révélant monosomes intacts. Enfin, une reconstruction 3D monosome est illustrée dans ce panneau.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des mitoribosomes humains intacts pour des études structurelles et biochimiques. Notre protocole offre des préparations finales de haute qualité qui pourraient être extrapolées à d’autres macromolécules mitochondriques.
