Ces travaux ont été soutenus par le Département provincial de la science et de la technologie du Sichuan (2021YJ0175).

Le protocole et les procédures expérimentales ont reçu l’approbation du Comité administratif et de recherche animale de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (numéro d’enregistrement : 2022DL-010). Des rats Sprague Dawley (SD) mâles âgés de huit semaines, pesant de 180 à 200 g, ont été obtenus dans le commerce (voir le tableau des matériaux) et logés dans un cycle de lumière/obscurité naturelle à température contrôlée (23 ± 2 °C) et humidité relative (55 % ± 10 %). Douze rats ont été répartis au hasard en deux groupes : le groupe témoin et le groupe AR. Tous les rats ont été acclimatés à ces conditions et ont eu un accès gratuit à la nourriture et à l’eau pendant une semaine avant l’essai.
1. Mise en place d’un modèle de RA chez le rat
<ol><li>Préparation de la solution sensibilisante : suspendre 30 mg d’ovalbumine (OVA) et 3 g d’Al(OH)3 dans 100 mL de solution saline (voir tableau des matériaux)14,15.</li>
	<li>Sensibilisation de base : saisir et tenir le rat complètement éveillé avec son abdomen vers le haut. Désinfectez l’abdomen à l’aide de boules de coton imbibées d’alcool à 75 %. À l’aide d’une seringue de 1,5 mL, injecter 1 mL de la solution sensibilisante préparée à l’étape 1.1 dans la cavité abdominale gauche des rats du groupe AR. Répétez cette injection une fois tous les deux jours pendant 14 jours (Figure 1A). REMARQUE : Assurez-vous que la tête du rat est positionnée plus bas que sa queue pour éviter d’endommager le gros intestin et l’intestin grêle lors de l’insertion de la seringue. Le site d’injection est situé à 1,5 cm de la ligne médiane ventrale. Les rats du groupe témoin doivent recevoir des injections intrapéritonéales de 1 mL de solution saline normale une fois tous les deux jours pendant 14 jours.</li>
	<li>Provocation nasale : Administrer 50 μL d’OVA à 5 % par gouttes nasales à l’aide d’une pipette de 100 μL (Figure 1B) le lendemain de la sensibilisation basale, en répétant cette procédure pendant 7 jours (Figure 1C). REMARQUE : Préparer la solution d’OVA à 5 % en mélangeant 5 g d’OVA avec 100 mL de solution saline. Pour le groupe témoin, administrez des gouttes du même volume de solution saline.</li>
</ol>2. Évaluation comportementale des rats
<ol><li>Dans les 30 minutes suivant la fin de l’épreuve nasale finale, observez et enregistrez les rats à l’aide d’un appareil photo numérique pour identifier les symptômes tels que le grattage nasal, les éternuements et l’écoulement nasal, en fonction des critères de notation décrits dans le tableau 1 (figure 1D). REMARQUE : La confirmation de la réussite de la modélisation AR est basée sur l’obtention d’un score total de ≥5 points14.</li>
</ol>3. Acquisition d’échantillons de muqueuse nasale
<ol><li>Sacrifier des rats : sacrifier les rats en les exposant à une surdose de CO2. Ensuite, désinfectez les rats avec de l’éthanol à 75 % (voir le tableau des matériaux). À l’aide d’un scalpel, faites une incision le long des deux coins de la bouche afin d’exposer le tissu musculaire (figure 2A). Ensuite, coupez les articulations de l’os zygomatique et de la mandibule des deux côtés du crâne à l’aide de ciseaux à tissu (Figure 2B) et retirez la mandibule (Figure 2C).</li>
	<li>Exposition des fosses nasales : séparer la peau du maxillaire à l’aide d’un hémostatique (Figure 2D) pour exposer la cavité nasale (Figure 2E). Coupez la connexion osseuse entre la cavité nasale et le maxillaire avec des ciseaux à tissu (Figure 2F). Ensuite, coupez la connexion entre la cavité nasale et les os orbitaires des deux côtés au niveau du foramen sous-orbitaire (Figure 2G) et retirez la cavité nasale (Figure 2H).</li>
	<li>Fixation : placer la cavité nasale extraite dans du paraformaldéhyde à 4% pour la fixation et la conserver à température ambiante pendant 24-72 h (voir tableau des matériaux). REMARQUE : Assurez-vous que la quantité de fixateur de paraformaldéhyde utilisée est suffisante pour recouvrir complètement les sections pour une fixation correcte.</li>
</ol>4. Prétraitement des échantillons de muqueuse nasale
<ol><li>Décalcification : commencez par fixer les tissus retirés de l’étape 3.1. Lavez-les trois fois avec du PBS pendant 20 min chacun. Ensuite, lavez-les trois fois avec de l’eau distillée, chaque fois pendant 20 minutes. Ensuite, détartrez les tissus dans une solution de décalcification d’un volume de 20 à 30 fois celui des tissus à température ambiante.<ol><li>La solution de décalcification (voir le tableau des matériaux) doit maintenir un pH de 7,2 à 7,4. Enfin, placez le tissu détartré dans une boîte de déshydratation. REMARQUE : La solution de détartrage doit être changée chaque semaine. Le processus de décalcification peut être terminé lorsque le tissu se ramollit (environ 2 mois).</li>
	</ol></li>
	<li>Déshydratation et épilation à la cire : transférer la boîte de déshydratation dans un déshydrateur (voir tableau des matériaux). Commencez avec 75 % d’alcool pendant 4 h, suivi de 85 % d’alcool pendant 2 h, de 90 % d’alcool pendant 2 h et de 95 % d’alcool pendant 1 h.<ol><li>Ensuite, plongez le tissu dans de l’éthanol anhydre pendant 30 minutes, répétez le processus pendant 30 minutes supplémentaires, utilisez du xylène pendant 5 à 10 minutes, répétez cette étape pendant encore 5 à 10 minutes, plongez le tissu dans de la cire pendant 1 h, répétez cette étape pendant une autre heure et enfin, plongez le tissu dans de la cire pendant 1 heure supplémentaire.</li>
	</ol></li>
	<li>Enrobage : placez le bloc de cire fondu dans la boîte d’enrobage (voir tableau des matériaux) et conservez-le dans un congélateur à -20 °C. Une fois que la cire s’est solidifiée, retirez-la et coupez le bloc de cire.</li>
	<li>Tranchage : insérez le bloc de cire paré dans un microtome de paraffine (voir tableau des matériaux) et coupez-le en tranches d’une épaisseur de 3 μm. Placez les tranches au bain-marie à 40 °C sur un épandeur à glissière. Aplatissez le mouchoir, puis soulevez-le à l’aide d’une lame de verre et faites-le cuire au four à 60 °C.<ol><li>Une fois que l’eau s’est évaporée et que la cire est correctement prise, retirez les lames et stockez-les à une température de 25 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Coloration H&E du tissu muqueux nasal
<ol><li>Déparaffinage et hydratation : placez les tranches dans du xylène pendant 20 min, répétez le processus pendant encore 20 min, de l’éthanol absolu pendant 5 min, répétez cette étape pendant encore 5 min, de l’alcool à 75% pendant 5 min, et enfin, lavez pendant 5 min.</li>
	<li>Coloration à l’hématoxyline : distribuer 100 μL de solution de coloration à l’hématoxyline (voir Tableau des matériaux) pendant 3 à 5 min à l’aide d’une pipette de 100 μL, rincer pendant 5 à 10 s, ajouter 100 μL d’éthanol d’acide chlorhydrique à 0,5 % pendant 10 à 30 s, rincer pendant 5 à 10 s, ajouter 100 μL d’eau ammoniacale à 0,2 % pendant 10 à 30 s et rincer pendant 30 s. REMARQUE : Après la coloration à l’hématoxyline, la différenciation avec de l’éthanol d’acide chlorhydrique à 0,5% est nécessaire pour éliminer l’excès de colorant hématoxyline lié au noyau et absorbé par le cytoplasme. Lorsque la coloration à l’éosine est effectuée, les noyaux et le cytoplasme seront clairement colorés. Les tranches apparaîtront rouges ou roses après la différenciation avec de l’éthanol d’acide chlorhydrique à 0,5%, alors rincez immédiatement après la différenciation pour éliminer l’acide des tranches de tissu afin d’arrêter la différenciation. Ensuite, utilisez de l’eau à 0,2 % d’ammoniac pour améliorer la coloration nucléaire.</li>
	<li>Coloration à l’éosine : utiliser une pipette de 100 μL pour distribuer 100 μL de solution de coloration à l’éosine (voir tableau des matériaux) pendant 5 min et rincer pendant 30 s.</li>
	<li>Déshydratation et scellage : plongez les tranches dans de l’éthanol absolu pendant 5 min, répétez le processus pendant encore 5 min, répétez une fois de plus pendant 5 min, diméthyle pendant 5 min et xylène pendant 5 min. Enfin, scellez avec de la résine neutre (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Placer la section colorée sur le microscope : positionnez la section colorée sur le microscope, ajustez la mise au point du microscope jusqu’à ce que l’image soit clairement visible, réglez le grossissement sur 40x et capturez l’image.</li>
</ol>6. Immunomarquage multicolore du tissu muqueux nasal
<ol><li>Déparaffinage et hydratation : suivez les mêmes que ceux mentionnés à l’étape 5.1.</li>
	<li>Traitement tampon citrate-phosphate : placer le tampon citrate-phosphate (pH 6,0) (voir tableau des matériaux) dans un récipient allant au micro-ondes. Chauffez-le jusqu’à ébullition, retirez-le, puis ajoutez les lames dans le récipient. Cuire au micro-ondes à feu moyen pendant 8 min jusqu’à ébullition, éteindre le feu pendant 8 min, puis passer à feu moyen-doux pendant 7 min.<ol><li>Après refroidissement naturel, transférez les tranches dans du PBS (pH 7,4), secouez-les et lavez-les trois fois à l’aide d’un shaker décolorant, à chaque fois pendant 5 min. REMARQUE : Assurez-vous que le tampon ne s’évapore pas pendant ce processus et évitez que les tranches ne se dessèchent.</li>
	</ol></li>
	<li>Blocage de la peroxydase endogène : séchez les tranches, tracez un cercle autour du tissu avec un stylo immunohistochimique (pour empêcher l’anticorps de s’écouler) et appliquez une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % (peroxyde d’hydrogène : eau pure = 1 :9).<ol><li>Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 15 min. Après refroidissement naturel, placez les tranches dans du PBS (pH 7,4) et secouez-les sur un shaker décolorant pendant trois cycles de 5 min chacun.</li>
	</ol></li>
	<li>Blocage : appliquer 5% de sérum de chèvre dans le cercle et incuber pendant 30 min.</li>
	<li>Ajout d’anticorps primaires : retirez délicatement la solution bloquante, ajoutez FOXP3 (dilution : 1 :200, voir tableau des matériaux) à la tranche et placez-la dans une chambre humide. Incuber à 4 °C pendant la nuit. REMARQUE : Ajoutez une petite quantité d’eau dans la chambre humide pour empêcher l’évaporation des anticorps.</li>
	<li>Ajout d’anticorps secondaires : placer les tranches dans du PBS (pH 7,4) et les agiter sur un shaker décolorant pendant trois cycles de 5 min chacun. Séchez délicatement les tranches et appliquez l’anticorps secondaire (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, voir Tableau des matériaux) à l’intérieur du cercle. Incuber à température ambiante pendant 50 min dans l’obscurité.</li>
	<li>Préparation de la solution de dilution de Tyramide : mélanger 100 μL de 3% H2 O2 avec 100 mL de 1x TBST (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Ajout de la solution de travail TSA : Mélanger 1 mL de diluant de Tyramide avec 2 μL de CY3-Tyramide pour préparer la solution de travail TSA. Appliquer 100 μL de solution de travail TSA sur chaque tranche et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les tranches avec du PBS trois fois, 5 min à chaque fois. REMARQUE : Préparez et utilisez immédiatement la solution de travail TSA et stockez-la à 4 °C dans l’obscurité ; Il est valable jusqu’à 24 h.</li>
	<li>Répétez les étapes 6.2 à 6.8 : passez à une dilution de 1 :200 de RORγt (colorant fluorescent FITC), puis à une dilution de 1 :200 de TICAM1 (colorant TYP620) (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Noyaux contre-colorés DAPI : secouer doucement les tranches pour les sécher, appliquer la solution colorante DAPI et incuber à température ambiante pendant 10 min dans l’obscurité.</li>
	<li>Autofluorescence de trempe : placer les tranches dans du PBS (pH 7,4) et les agiter sur un shaker décolorant pendant trois cycles de 5 min chacun. Appliquez le désaltérant d’autofluorescence (voir tableau des matériaux) sur les tranches, attendez 5 min, puis lavez pendant 10 min.</li>
	<li>Blocage : placer les tranches dans du PBS (pH 7,4) et les agiter sur un shaker décolorant pendant trois cycles de 5 min chacun. Secouez doucement les tranches pour les sécher et scellez-les avec la pastille anti-fluorescence (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Microscopie : placez la section colorée sur le microscope, ajustez la mise au point du microscope pour une visibilité claire, réglez le grossissement sur 20x et 40x et capturez l’image. REMARQUE : DAPI a une longueur d’onde d’excitation UV de 330-380 nm et une longueur d’onde d’émission de 420 nm (lumière bleue). Le FITC a une longueur d’onde d’excitation de 465 à 495 nm et une longueur d’onde d’émission de 515 à 555 nm (lumière verte). CY3 a une longueur d’onde d’excitation de 510-560 nm et une longueur d’onde d’émission de 590 nm (lumière rouge). Le TYP-690 a une longueur d’onde d’excitation de 630 nm et une longueur d’onde d’émission de 690 nm (lumière rose).</li>
</ol>

Immunofluorescence multicolore du tissu nasal dans un modèle de rat allergique à la rhinite

<ol>
	<li>Bro&#380;ek, J. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+the+transcription+factor+Foxp3+leads+to+the+generation+of+pathogenic+memory+T+cells+in+Vivo.">Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo.</a> Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).</li><li>Ziegler, S. F., Buckner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+and+the+regulation+of+Treg/Th17+differentiation.">Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation.</a> Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).</li><li>Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+research+advances+of+toll-like+receptors+and+allergic+rhinitis.">Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis.</a> Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).</li><li>Shan, H., Jie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+TLR4+gene+polymorphisms+and+allergic+rhinitis.">Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis.</a> Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).</li><li>Xu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+mechanism+of+Treg+cells+and+TICAM-1+patients+with+severe+allergic+rhinitis.">Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis.</a> Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1+CD8++T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+hpv-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Gustavson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+automated+quantitative+analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).</li><li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1/PD-L1+checkpoint+blockade:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li><li>Hernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+for+immune+cell+profiling+of+paraffin-embedded+tumor+tissues.">Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La rhinite allergique (RA) est une maladie inflammatoire non infectieuse de la muqueuse nasale résultant d’une combinaison de facteurs environnementaux et génétiques. Il est devenu un problème de santé mondial, ayant un impact sur l’efficacité au travail, diminuant la qualité de vie, altérant le sommeil, les fonctions cognitives et provoquant de l’irritabilité et de la fatigue. La réalité augmentée touche 10 à 20 % de la population mondiale¹ et entraîne des coûts économiques considérables, causant...

La rhinite allergique (RA) est une maladie inflammatoire chronique et non infectieuse de la muqueuse nasale principalement médiée par des immunoglobulines E (IgE) spécifiques1,2. Elle se caractérise par des symptômes tels que des éternuements, un écoulement nasal, une congestion nasale et des démangeaisons nasales. Avec l’industrialisation et l’urbanisation, la prévalence de la RA augmente progressivement, affectant environ 10 à 20 % de la population mondiale1. La technique d’immunofluorescence (IF) est une méthode de coloration fluorescente qui utilise une réaction de liaison anticorps-antigène. Il peut être utilisé pour détecter et quantifier les niveaux de distribution et d’expression de protéines spécifiques dans les tissus biologiques ou les cellules. Dans la recherche sur la RA, l’IF peut détecter simultanément plusieurs cibles, y compris les cytokines liées à la RA, les cellules inflammatoires, les récepteurs, etc., ce qui facilite l’exploration de la pathogenèse de la RA et des effets des médicaments 3,4,5,6.
Le processus de coloration par immunofluorescence multicolore (mIF) ressemble beaucoup à l’IF traditionnel, avec l’ajout d’une étape d’élution d’anticorps lors de chaque cycle de coloration. Cette modification permet la détection simultanée de plusieurs biomarqueurs sur la même coupe de tissu grâce à un marquage unique séquentiel et à plusieurs cycles de recoloration. mIF est basé sur l’amplification du signal tyramide (TSA), ce qui permet des cycles répétés de coloration fluorescente TSA et l’utilisation du chauffage par micro-ondes pour éliminer les anticorps tout en conservant les signaux fluorescents 7,8. Par rapport à l’IF conventionnelle, la FIm offre plusieurs avantages : (1) elle peut détecter des antigènes faiblement exprimés qui sont difficiles à identifier avec l’IF 9,10 conventionnelle ; (2) il fournit une coloration de haute qualité avec un rapport signal/bruit amélioré ; (3) il permet de quantifier les structures tissulaires spécifiques et les régions d’intérêt11 ; (4) le multiplexage de plusieurs voies utilise efficacement les tissus et préserve les ressources pathologiques limitées12 ; (5) L’analyse multiparamétrique par mIF offre des informations plus approfondies sur les tissus, découvrant des informations biologiques cachées13.
Dans l’ensemble, mIF permet d’observer différentes expressions et distributions d’antigènes au sein d’un même échantillon, facilitant ainsi l’étude des protéines cibles. À l’avenir, les chercheurs qui cherchent à comprendre l’expression et la distribution de plusieurs protéines cibles trouveront dans cette technique un choix précieux. Cette étude démontre l’application de la mIF pour la coloration d’échantillons de muqueuse nasale de rats avec AR et évalue l’établissement d’un modèle d’AR chez le rat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Al(OH)3</td>
			<td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A7130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% ethanol</td>
			<td>Anhui Yiren An Co., Ltd</td>
			<td>20210107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021070101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2022070501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescence quenching sealer</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic dyeing machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>Varistain Gemini ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier slides</td>
			<td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd</td>
			<td>220518001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-phosphate buffer&#160;</td>
			<td>Servicebio biotechnology co., Ltd</td>
			<td>G1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid antigen repair solution (PH 6.0)</td>
			<td>Xavier Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.</td>
			<td>220518001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td>
			<td>CS01-2450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3-Tyramide</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1223-50UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decoloring shaker</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>S1010E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA decalcification solution</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CR2203047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating blast dryer&#160;</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding box marking machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>&#160;PrintMate AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding machine</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JB-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast tissue dewatering machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>STP420 ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film sealer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>Autostainer 360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Tyramide</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1222-50UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Sunny Optical Technology Co.Ltd</td>
			<td>CX40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>bs-10211R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing table</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JB-L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Liankebio Co., Ltd</td>
			<td>GAR0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>DH0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td>
			<td>J31010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sichuan Xilong Science Co., Ltd</td>
			<td>210608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical pen</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BC004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Midea</td>
			<td>M1-L213B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral gum</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin&#160;</td>
			<td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A804010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palm centrifuge</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>D1008E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>P0099-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathology section scanner</td>
			<td>3DHISTECH Kft</td>
			<td>Pannoramic SCAN&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;</td>
			<td>Dragon</td>
			<td>KE0003087/KA0056573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ror&#947;t</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>DF3196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd</td>
			<td>20170022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B</td>
			<td>Bioengineering Co., Ltd</td>
			<td>A602008-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>HM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>HM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td>
			<td>PC2-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley rats</td>
			<td>Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine</td>
			<td>SYX <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65937/65937eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 2023-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TICAM-1</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>DF6289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td>
			<td>J22120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue spreading baking sheet machine</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JK-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYR-690 fluorescent dyes</td>
			<td>Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>RC0086-34RM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>SLK-O3000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath-slide drier</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JK-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax trimmer</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JXL-818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2022051901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling in nasal mucosa tissue sections of allergic rhinitis rats via multicolor immunoassay

La rhinite allergique (RA) est une maladie inflammatoire chronique et non infectieuse de la muqueuse nasale, principalement médiée par des immunoglobulines E (IgE) spécifiques, qui touche environ 10 à 20 % de la population mondiale. Alors que la coloration par immunofluorescence (FI) est depuis longtemps une technique standard pour détecter l’expression de protéines spécifiques à une maladie, les techniques IF conventionnelles sont limitées dans leur capacité à détecter les niveaux d’expression de trois protéines ou plus dans le même échantillon. Par conséquent, des techniques d’IF multicolores ont été développées ces dernières années, qui permettent le marquage simultané de plusieurs cibles dans des cellules ou des tissus.
Ce protocole fournit une vue d’ensemble complète du processus d’établissement d’un modèle d’AR chez le rat, d’obtention d’échantillons de muqueuse nasale et des procédures techniques d’immunofluorescence multicolore. Tous les rats du groupe AR présentaient des symptômes typiques tels que des éternuements, un écoulement nasal et des démangeaisons nasales, les observations comportementales obtenant un score de ≥5 points. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) a révélé une augmentation du nombre de cellules inflammatoires et une perturbation de l’intégrité de la muqueuse nasale dans le groupe AR. L’immunofluorescence multicolore (mIF) a démontré une augmentation de l’expression de RORγt et de TICAM-1, tandis que l’expression de Foxp3 a diminué dans le tissu de la muqueuse nasale des rats AR.

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE)1,2. It is characterized by symptoms such as sneezing, a runny nose, nasal congestion, and nasal itching. With industrialization and urbanization, the prevalence of AR is gradually increasing, affecting approximately 10%-20% of the world&#39;s population1. The immunofluorescence (IF) technique is a fluorescent staining method that utilizes an antibody-antigen binding reaction. It can be employed to detect and quantify the distribution and expression levels of specific proteins in biological tissues or cells. In AR research, IF can simultaneously detect multiple targets, including AR-related cytokines, inflammatory cells, receptors, and more, facilitating the exploration of AR pathogenesis and the effects of drugs3,4,5,6.
The multicolor immunofluorescence (mIF) staining process closely resembles traditional IF, with the addition of an antibody elution step during each round of staining. This modification enables the simultaneous detection of multiple biomarkers on the same tissue section through sequential single-labeling and multiple rounds of re-staining. mIF is based on tyramide signal amplification (TSA), allowing for repeated cycles of TSA fluorescent staining and the use of microwave heating to remove antibodies while retaining fluorescent signals7,8. In comparison to conventional IF, mIF offers several advantages: (1) it can detect weakly expressed antigens that are challenging to identify with conventional IF9,10; (2) it provides high-quality staining with an improved signal-to-noise ratio; (3) it allows for the quantification of tissue-specific structures and regions of interest11; (4) multiplexing multiple pathways efficiently utilizes tissues and conserves limited pathological resources12; (5) multi-parameter analysis through mIF offers deeper insights into tissues, uncovering hidden biological information13.
Overall, mIF allows the observation of different antigen expressions and distributions within the same sample, facilitating the study of target proteins. In the future, researchers seeking to understand the expression and distribution of multiple target proteins will find this technique a valuable choice. This study demonstrates the application of mIF for staining nasal mucosa samples from rats with AR and evaluate the establishment of a rat model of AR.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la recherche sur la rhinite allergique grâce à l’immunofluorescence multicolore

Marquage immunofluorescent dans des coupes de tissu de muqueuse nasale de rats atteints de rhinite allergique par immunodosage multicolore

Our main research is based on a study of allergic rhinitis. Our research intends to analyze what proteins are associated with allergic rhinitis. Multicolor immunofluorescence is currently used to advance research in our field.In future studies, we will focus on the possible mechanisms of TCM in the treatment of allergic rhinitis.

Six rats SD ont été induits avec succès dans le modèle AR par injection intrapéritonéale OVA et provocation nasale. La RA a été induite chez tous les rats du groupe AR, représentant 100% du groupe. Tous les rats du groupe AR présentaient des symptômes typiques tels que des éternuements, un écoulement nasal et des démangeaisons nasales. Toutes les observations comportementales ont obtenu un score de ≥5 points (tableau 2).
Les résultats de la coloration H&E au 2...

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Ce protocole décrit une technique d’immunofluorescence multicolore pour évaluer le modèle de rhinite allergique chez le rat.

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), ...

Notre recherche principale est basée sur une étude de la rhinite allergique. Notre recherche vise à analyser quelles protéines sont associées à la rhinite allergique. L’immunofluorescence multicolore est actuellement utilisée pour faire avancer la recherche dans notre domaine.Dans de futures études, nous nous concentrerons sur les mécanismes possibles de la MTC dans le traitement de la rhinite allergique.

immunofluorescent-labeling-nasal-mucosa-tissue-sections-allergic

Research

JoVE Journal

Medicine

Immunofluorescent Labeling in Nasal Mucosa Tissue Sections of Allergic Rhinitis Rats via Multicolor Immunoassay

1.1K vues.  Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. Notre recherche principale est basée sur une étude de la rhinite allergique. Notre recherche vise à analyser quelles protéines sont associées à la rhinite allergique. L’immunofluorescence multicolore est actuellement utilisée pour faire avancer la recherche dans notre domaine.Dans de futures études, nous nous concentrerons sur les mécanismes possibles de la MTC dans le traitement de la rhinite allergique.

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la recherche sur la rhinite allergique grâce à l’immunofluorescence multicolore

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), affecting approximately 10%-20% of the world's population. While immunofluorescence (IF) staining has long been a standard technique for detecting disease-specific protein expression, conventional IF techniques are limited in their ability to detect the expression levels of three or more proteins in the same sample. Consequently, multicolor IF techniques have been developed in recent years, which allow the simultaneous labeling of multiple targets in cells or tissues.
This protocol provides a comprehensive overview of the process for establishing a rat model of AR, obtaining nasal mucosal samples, and the technical procedures for multicolor immunofluorescence. All rats in the AR group exhibited typical symptoms such as sneezing, a runny nose, and an itchy nose, with behavioral observations scoring &#8805;5 points. Hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining revealed increased inflammatory cell counts and disrupted nasal mucosal integrity in the AR group. Multicolor immunofluorescence (mIF) demonstrated increased expression of ROR&#947;t and TICAM-1, while Foxp3 expression decreased in the nasal mucosa tissue of AR rats.

This protocol describes a multicolor immunofluorescence technique for evaluating the rat model of allergic rhinitis.

Recherche

Médecine

Acquisition and Pre-Processing of Nasal Mucosal Samples from Rats with Allergic Rhinitis

To begin, with a scalpel, make a precise incision along the two corners of the mouth of a euthanized rat to expose the muscle tissue. Use a pair of tissue scissors to cut the joints of the zygomatic bone and the mandible on both sides of the skull. Then remove the mandible.Use tissue scissors to cut the bony connection between the nasal cavity and the maxilla. Then use a hemostat to separate the skin of the maxilla to expose the nasal cavity. Sever the connection between the nasal cavity and the orbital bones on both sides at the infraorbital foramen, and remove the nasal cavity.Place the extracted nasal cavity in a 4%Paraformaldehyde solution for fixation. To decalcify the tissue, wash the fixed tissue with distilled water. Place the tissues in a decalcification solution with a volume 20 to 30 times that of the tissues at room temperature.Once decalcification is complete, place the tissue in a dehydration box. Transfer the dehydration box to a dehydrator and dehydrate the tissue in increasing alcohol concentrations at different incubation times. Next, place the tissue in anhydrous ethanol for 30 minutes for two cycles.Following this, transfer the tissue to xylene for five to 10 minutes and repeat, then immerse the tissue in wax for one hour. Place the wax block in embedding cassettes. Remove the wax blocks after they have solidified and trim the wax block.Insert the trimmed wax block into a paraffin microtome and cut it into three micrometer thick slices. Hematoxylin and eosin staining of the control rats showed well arranged and cilia. The nasal septum mucosa was damaged and detached in the disease group with notable neutrophil infiltration.

Acquisition et prétraitement d’échantillons de muqueuse nasale chez des rats atteints de rhinite allergique

Multicolor Immunostaining of Nasal Mucosal Tissues of Rats with Allergic Rhinitis

To begin, place the hematoxylin and eosin stained rat nasal mucosal tissue sections onto a microscope stage. Adjust the microscope's focus until the image is clearly visible. Capture the tissue image at 40X.Heat the citrate phosphate buffer until it boils. Then add the slides to the container after removing it from the heat. After heating for eight minutes until boiling, turn off the heat for eight minutes and subsequently switch to medium low heat for seven minutes.After allowing the container to cool naturally transfer the slices to PBS. Use a decolorizing shaker to shake the slices for five minutes. Next draw a circle around the dried tissue with an immunohistochemical pen.Add 3%hydrogen peroxide solution to the slices before incubating. Then transfer the slices to PBS for washing as before. To block, apply 5%goat serum within the marked circle.After incubation, carefully remove the blocking solution and add one to two milliliters of FOXP3 to the tissue slices. Then place the slices in a humid chamber for overnight incubation. After washing the slices in PBS, gently dab the slices dry with filter paper.Then add one to two milliliters of the secondary antibody solution to the slices. Next incubate the slices in 100 microliters of tyramide signal amplification working solution for 10 minutes at room temperature in the dark. After incubation, wash the slices with PBS three times for five minutes each.Now apply one to two milliliters of DAPI staining solution to the slices before incubation. Quench the auto fluorescence by incubating the slices in the quencher for five minutes before a 10 minute PBS wash. Then seal them with the anti fluorescence quencher.Capture the microscopic images of the stained sections under 20X and 40X magnification. Hematoxylin and eosin staining of the control rats showed well arranged epithelial cells and cilia. The nasal septum mucosa was damaged and detached in the disease group with notable neutrophil infiltration.Multi immunofluorescent staining revealed that the expressions of ROR Gamma T and TCAM1 were increased in the disease group. However, FOXP3 was under expressed.