Ce protocole a été conçu pour aborder une question très importante et non résolue sur la façon dont les substances microbiennes présentes et les allergènes environnementaux peuvent réguler le développement de l’inflammation allergique. Plus précisément, les méthodes présentées ici peuvent aider à répondre si les espèces d’ARN à double brin dans les acariens de la poussière domestique sont immunogènes in vivo et capables de moduler l’inflammation pulmonaire éosinophile. Les principaux avantages de ces techniques sont qu’elles sont simples, efficaces, hautement reproductibles et peuvent être réalisées à l’aide d’outils et d’équipements couramment utilisés.
Ces méthodes peuvent également être utilisées pour évaluer les maladies pulmonaires causées par les infections virales respiratoires. Li She, une étudiante diplômée de mon laboratoire, aidera à démontrer la procédure. Commencez par isoler l’ARN total des allergènes, des insectes et des allergènes non insectes.
Transférer une quantité appropriée de spécimen dans un tube de deux millilitres contenant 1,4 millimètre de perles de céramique et congeler les tubes dans un contenant d’azote liquide pendant environ 10 minutes. Ajouter un millilitre de réhésif d’isolement d’ARN à base de guanidinium à base de thiocyanate à chaque tube. Ensuite, brisez l’insecte et les petits animaux non insectes avec un perturbateur cellulaire à haute énergie à vitesse maximale pendant 45 secondes.
Réfrigérer l’échantillon sur la glace et répéter ce processus deux fois. Transférez la solution dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Ajouter 200 microlitres de chloroforme à chaque tube et vortexer l’échantillon.
Centrifuger les tubes à 14 000 fois g pendant 14 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube contenant 500 microlitres d’isopropanol. Mélanger l’échantillon.
Puis centrifugez-le à 14 000 fois g pendant 14 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez soigneusement le surnatant. Ensuite, lavez la pastille d’ARN avec 500 microlitres de 75% d’éthanol, et centrifugez-la à 7 500 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Retirer soigneusement tout le liquide. Séchez à l’air le granulé et dissolvez l’ARN avec 20 à 50 microlitres d’eau sans RNase. Pour détecter les structures d’ARN à double brin dans l’ARN total, placez deux microlitres de l’échantillon d’ARN de 200 nanogrammes par microlitre sur la membrane de nylon chargée positivement.
Reliez les échantillons à la membrane à 1200 microjoules par 100 dans un lien croisé UV. Répétez le repérage et le croisement deux fois de plus, ce qui se traduira par un total de 1,2 microgramme d’ARN par tache. Bloquez la liaison non spécifique avec 5% de lait dans tbs-t pendant une heure tout en secouant à température ambiante.
Ensuite, retirez la solution de blocage, et ajoutez l’anticorps anti-ARN J2 à double brin à une dilution de 1 à 1000 dans 1% de lait dans tbs-T. Incuber la membrane pendant la nuit en secouant à quatre degrés Celsius. Le lendemain, laver la membrane trois fois avec le TBS-T pendant cinq minutes par lavage.
Ajouter l’anticorps secondaire et incuber la membrane pendant une heure à température ambiante. Répétez ensuite les lavages avec tbs-T. Ajouter le substrat et incuber la membrane pendant cinq à 15 minutes jusqu’à ce qu’un signal désiré soit visible.
Arrêtez la réaction en rinçant la membrane avec de l’eau doublement distillée. Pour recueillir les échantillons pulmonaires, placez les poumons sur des papiers de soie et excisez un petit morceau de chaque lobe pulmonaire. Placez chaque pièce dans un tube de deux millilitres contenant des perles.
Pour recueillir le lavage bronchoalveolar, désinfecter une souris euthanasiée avec 70% d’éthanol, et utiliser des ciseaux pour couper la peau de la partie supérieure de l’abdomen au cou. Tirez doucement les glandes salivaires et le muscle sternohyoid à part avec des forceps pour exposer la trachée. Placez ensuite une ficelle de nylon en dessous.
Faire une incision dans la trachée environ deux millilitres sous le larynx juste assez pour insérer une canule, et nouer la ficelle autour de la trachée et la canule. Fixez une seringue à l’extrémité de la canule et chargez-la avec du PBS-EDTA frais. Injectez et aspirez ensuite un millilitre de la solution dans le poumon.
Détachez la seringue de la canule et éjectez la solution dans un tube de 15 millilitres. Répétez ce processus sur la glace avec pbs-EDTA frais, et mettre en commun le lavage. Centrifuger le tube à 500 fois g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius.
Enregistrez ensuite le volume et transférez le supernatant sur deux tubes de 1,5 millilitre sans déranger la pastille. Après avoir réutilisé la pastille, transférer 150 microlitres dans une plaque de 96 puits et centrifuger la plaque pendant sept minutes à 500 fois g et quatre degrés Celsius. Puis inverser rapidement la plaque sur du papier de soie pour enlever le surnatant.
Tacher les cellules avec des anticorps dans le tampon FACS en présence de 2,4G2 bloquant l’anticorps, et incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après coloration, centrifuger la plaque pour pelleter les cellules à 500 fois g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Enlever la solution de coloration en inversant la plaque sur du papier de soie.
Ajouter 100 microlitres de tampon FACS pour laver les cellules, puis répéter la centrifugation. Resuspendez les échantillons dans 150 microlitres de tampon FACS, puis transférez-les dans des tubes FACS contenant 350 microlitres supplémentaires de tampon. Ajouter 25 microlitres de perles de comptage à chaque échantillon, et procéder à l’analyse de cytométrie de flux.
La présence de longues structures d’ARN à double brin dans les acariens domestiques, les insectes et les petits animaux non insectes a été examinée par tache à points à l’aide d’un anticorps monoclonal de souris à double brin et spécifique à l’ARN. RNase III a été utilisé pour digérer l’ARN à double brin en 12 à 15 fragments de paire de base, qui étaient indétectables par J2. La capacité de l’ARN total d’acarien de poussière de maison pour stimuler une réponse immunisée innée dans les poumons de souris a été démontrée par RT-qPCR. Le traitement de RNase III a aboli l’activité immunostimulatoire de l’ARN total d’acarien de poussière de maison, indiquant que les structures doubles-échouées d’ARN sont essentielles pour l’activité immunisée innée dans les poumons.
L’effet inhibiteur de l’ARN total d’acarien de poussière de maison sur le développement d’une inflammation pulmonaire grave de type deux a été évalué avec l’analyse de FACS. L’inflammation éosinophile de poumon a été induite par des extraits d’acarien de poussière, qui ont été traités avec ou sans RNase III. La dégradation de longues espèces d’ARN à double brin a entraîné une inflammation pulmonaire grave de type deux, reflétée par l’augmentation du nombre d’éosinophiles dans le lavage bronchoalveolar et les poumons.
Notamment, le nombre d’éosinophiles dans le groupe total traité par ARN par acariens est comparable au groupe traité avec l’extrait original d’acarien de poussière qui contenait endogènement les longues espèces d’ARN à double brin. Lorsque vous essayez ce protocole, soyez très prudent lors de l’injection et de la récoltation du liquide BAL, car tout dommage aux poumons à ce stade peut modifier les résultats finaux. En plus de cette procédure, d’autres méthodes comme ELISA peuvent être effectuées pour analyser le contenu soluble non cellulaire présent dans le fluide BAL.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer d’autres substances microbiennes présentes dans les allergènes environnementaux, tels que les facteurs d’ARN non à double brin qui peuvent réguler le développement de l’inflammation pulmonaire allergique.
