Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32370135), le Programme d’innovation de l’Académie chinoise des sciences agricoles (CAAS-CSAL-202302), le Projet scientifique et technologique du Collège professionnel d’agriculture et de foresterie du Jiangsu (2021kj29).

1. Culture hydroponique stérile d’A. thaliana
<ol><li>Préparez les plants d’A. thaliana .<ol><li>Préparez le milieu de culture des semis d’A. thaliana , qui se compose de 1/2 milieu MS (Murashige et Skoog) avec 2 % (poids/vol) de saccharose et 0,9 % (poids/volume) de gélose.</li>
		<li>Verser le milieu de stérilisation préparé dans des boîtes de Pétri carrées stériles (13 cm x 13 cm) avant la solidification. Évitez le séchage à l’air pour maintenir l’humidité.</li>
		<li>Immerger les graines d’A. thaliana dans un tube de microcentrifugation de 2 mL rempli de 1 mL d’eau stérile à 4 °C pendant plus de 12 h, puis stériliser les graines avec 1 mL de NaClO à 2 % (vol/vol) pendant 2 min.</li>
		<li>Lavez soigneusement les graines avec de l’eau stérile six fois pour éliminer la solution de NaClO. Semez les graines sur des boîtes de Pétri avec un milieu gélosé MS avec une pointe stérile de 1 mL.</li>
		<li>Scellez les boîtes de Pétri avec du ruban médical respirant et placez-les verticalement dans un incubateur léger pour qu’elles poussent pendant 1 semaine. Réglez le rapport jour/nuit de l’incubateur de lumière sur 16 h/8 h, maintenez la température à 23 °C et l’humidité à 40%-60%.</li>
	</ol></li>
	<li>Repiquage A. thaliana.<ol><li>Découpez des trous de 5 mm sur un colorateur de cellules de 40 μm et stérilisez-les.</li>
		<li>Transplantez trois plants d’A. thaliana âgés de 7 jours dans les trous d’une passoire cellulaire et placez-les dans une plaque à 6 puits contenant 3 mL de milieu liquide stérile 1/2 MS avec 0,5 % de saccharose.</li>
		<li>Placez les plaques à 6 puits dans un incubateur léger (figure 1A) et incubez pendant 10 jours.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Culture et inoculation de bactéries
<ol><li>Préparez une suspension bactérienne pour l’inoculation.<ol><li>Pour Bacillus velezensis, inoculer des cellules bactériennes dans un milieu LB stérile et incuber à 37 °C en agitant à 170 tr/min jusqu’à ce qu’il atteigneune OD 600 de 0,8-1,2.</li>
		<li>Prélever les cellules bactériennes par centrifugation à 6000 x g pendant 2 min et remettre les cellules en suspension dans un tampon PBS (2 mM KH,2PO4, 8 mM Na,2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Répétez les étapes de centrifugation et de remise en suspension 3 fois pour éliminer le milieu LB et les métabolites bactériens.</li>
		<li>Mettre en suspension les cellules bactériennes dans un milieu frais 1/2 MS à une concentration finale deOD 600 0,01. Inoculez les suspensions de bactéries aux plaques à 6 puits qui font pousser les semis d’A. thaliana , placez les plaques à 6 puits dans l’incubateur léger et cultivez-les pendant 2 jours.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Mesurer les bactéries colonisées sur les racines
<ol><li>Récoltez le tissu racinaire et mettez en plaque les cellules colonisées. REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées dans des conditions gnotobiotiques<ol><li>Pesez les tubes de 2 ml et notez le poids comme W0.</li>
		<li>Récoltez les tissus racinaires d’A. thaliana co-cultivés et lavez-les 3 fois dans de l’eau stérile. Placez la racine sur du papier filtre pour enlever l’excès d’eau.</li>
		<li>Placez la racine dans le tube de microcentrifugation pesé, pesez les racines avec le tube et enregistrez-le en W1.</li>
		<li>Ajoutez 1 mL de PBS dans chaque tube et agitez les tubes pendant 8 min à la vitesse maximale.</li>
		<li>Diluer les suspensions avec les cellules bactériennes colonisées par les racines collectées à 1 x 10-1-1 x 10-4 (selon la capacité de colonisation bactérienne). Étaler les suspensions bactériennes diluées sur des plaques contenant du milieu gélosal LB et incuber à 37 °C pendant 10 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Comptez les colonies et normalisez les données.<ol><li>Comptez les colonies bactériennes sur des plaques LB.</li>
		<li>Calculer les UFC en fonction de la dilution correspondante et normaliser les données avec le poids frais des racines (W1-W 0). Les résultats finaux indiquent le nombre de cellules bactériennes colonisées par gramme de racine 2 jours après l’inoculation (figure 1B).</li>
	</ol></li>
</ol>

Détection de la colonisation par des rhizobactéries chez Arabidopsis thaliana

<ol>
	<li>Wang, B., Wan, C., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+on+cotton+plants+with+a+GFP+labeled+strain+of+Bacillus+axarquiensis.">Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis.</a> Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).</li><li>Zhai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+tool+for+production+of+GFP-expressing+Rhodopseudomonaspalustris+for+visualization+of+bacterial+colonization.">A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization.</a> AMB Express. 9 (1), 141 (2019).</li><li>Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+plant+colonization+by+beneficial+endophytic+Enterobacter+sp.+SA187.">Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187.</a> Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+velezensis+tolerance+to+the+induced+oxidative+stress+in+root+colonization+contributed+by+the+two-component+regulatory+system+sensor+ResE.">Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE.</a> Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+commensal+type+VII+secretion+system+causes+iron+leakage+from+roots+to+promote+colonization.">Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization.</a> Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chemotaxis+compounds+in+root+exudates+and+their+sensing+chemoreceptors+in+plant-growth-promoting+Rhizobacteria+Bacillus+amyloliquefaciens+SQR9.">Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9.</a> Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).</li><li>Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoderma:+a+multipurpose,+plant-beneficial+microorganism+for+eco-sustainable+agriculture.">Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture.</a> Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).</li><li>Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+study+on+colonization+and+antimicrobial+property+of+endophytic+bacteria+associated+with+ethnomedicinal+plants+of+Meghalaya.">Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya.</a> J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).</li><li>Ravelo-Ortega, G., Raya-Gonz&#225;lez, J., L&#243;pez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+rhizosphere+microbes+that+promote+plant+growth.">Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth.</a> Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).</li><li>Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+from+distance:+attraction+of+soil+bacteria+by+plant+root+volatiles.">Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles.</a> ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).</li><li>Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbe-induced+plant+volatiles.">Microbe-induced plant volatiles.</a> New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).</li><li>Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+members+increase+Bacillus+subtilis+maintenance+on+the+roots+of+Arabidopsis+thaliana.">Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana.</a> Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria.">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).</li><li>Yahya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+root+exudation+and+architecture+for+improved+growth+of+wheat+mediated+by+phosphate+solubilizing+bacteria.">Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria.</a> Front Microbiol. 12, 744094 (2021).</li><li>Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genomic+insight+of+surfactin-producing+Bacillus+velezensis+and+its+biocontrol+potential+against+pathogenic+contamination+in+lettuce+hydroponics.">Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts avec le contenu de cet article.

Pour obtenir une bonne reproductibilité, il y a quatre étapes critiques pour le processus de détection de la colonisation de ce protocole. Tout d’abord, il est nécessaire de s’assurer que le nombre de cellules bactériennes inoculées est exactement le même dans chaque expérience. Deuxièmement, il est également nécessaire de contrôler l’intensité du nettoyage des bactéries non colonisées avec de l’eau stérile. Troisièmement, chaque processus de dilution d’échantillon doit être vortex avant d’...

Il existe des méthodes quantitatives et qualitatives pour détecter la colonisation de la rhizosphère par une seule souche bactérienne. Pour la méthode qualitative, il faut utiliser une souche qui exprime constitutivement la fluorescence, et la distribution et l’intensité de la fluorescence doivent être examinées à l’aide d’instruments de microscopie à fluorescence ou d’instruments confocaux laser 1,2. Ces stratégies peuvent bien refléter la colonisation bactérienne in situ3, mais elles ne sont pas aussi précises que les méthodes traditionnelles de comptage sur plaque en matière de quantification. De plus, en raison de la limitation de l’affichage de zones racinaires partielles au microscope, elle peut parfois être influencée par un biais subjectif.
Ici, nous décrivons une méthode quantitative, qui comprend la collecte des cellules bactériennes colonisées et le comptage des UFC bactériennes sur une plaque. Cette méthode est basée sur la dilution et le placage par lesquels les souches colonisées qui ont été retirées des racines des plantes peuvent être comptées, et le nombre total de bactéries colonisées sur la racine peut être calculé 4,5.
Tout d’abord, A. thaliana a été cultivé dans des conditions hydroponiques, puis des cellules bactériennes ont été inoculées dans la rhizosphère à une concentration finale de 0,01 OD600. Les tissus racinaires infectés ont été récoltés 2 jours après l’inoculation et lavés dans de l’eau stérile pour éliminer les cellules bactériennes non colonisées. De plus, les cellules bactériennes colonisées sur la racine ont été recueillies, diluées dans un tampon salin tamponné au phosphate (PBS) et plaquées sur un milieu gélosé Luria-Bertani (LB). Après une incubation à 37 °C pendant 10 h, des colonies individuelles sur des plaques LB ont été comptées et normalisées pour déterminer les cellules bactériennes colonisées sur les racines.
Cette méthode est très applicable, a une bonne répétabilité et est plus adaptée à la détermination précise de la colonisation bactérienne de la rhizosphère.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cell stainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8200-40&#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium</td>
			<td>Hopebio</td>
			<td>HB8469-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Alfa</td>
			<td>L14709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dish</td>
			<td>Ruiai Zhengte</td>
			<td>PYM-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bacterial colonization on arabidopsis thaliana roots in hydroponic condition

La mesure de la colonisation bactérienne sur la racine d’Arabidopsis thaliana est l’une des expériences les plus fréquentes dans les études d’interaction plante-microbe. Une méthode standardisée de mesure de la colonisation bactérienne dans la rhizosphère est nécessaire pour améliorer la reproductibilité. Nous avons d’abord cultivé des A. thaliana stériles dans des conditions hydroponiques, puis nous avons inoculé les cellules bactériennes dans la rhizosphère à une concentration finale deDO 600 de 0,01. 2 jours après l’inoculation, le tissu racinaire a été récolté et lavé trois fois dans de l’eau stérile pour éliminer les cellules bactériennes non colonisées. Les racines ont ensuite été pesées, et les cellules bactériennes colonisées sur la racine ont été collectées par vortex. La suspension cellulaire a été diluée en gradient avec un tampon salin tamponné au phosphate (PBS), suivie d’un placage sur un milieu gélosé Luria-Bertani (LB). Les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 10 h, puis les colonies individuelles sur les plaques LB ont été comptées et normalisées pour indiquer les cellules bactériennes colonisées sur les racines. Cette méthode est utilisée pour détecter la colonisation bactérienne dans la rhizosphère dans des conditions de mono-interaction, avec une bonne reproductibilité.

There are quantitative and qualitative methods for detecting rhizosphere colonization by a single bacterial strain. For the qualitative method, a strain that constitutively expresses fluorescence should be used, and the fluorescence distribution and intensity should be examined under fluorescence microscopy or laser confocal instruments1,2. Those strategies can well reflect bacterial colonization in situ3, but they are not as accurate as traditional plate counting methods in quantification. Besides, due to the limitation of only displaying partial root zones under the microscope, sometimes it can be influenced by subjective bias. 
Here, we describe a quantitative method, which includes collecting the colonized bacterial cells and counting the bacterial CFUs on a plate. This method is based on dilution and plating by which the colonized strains that were stripped from plant roots can be counted, and the total colonized bacteria number on the root can be calculated4,5. 
First, A. thaliana was cultured in hydroponic conditions, and then bacterial cells were inoculated in the rhizosphere at a final concentration of 0.01 OD600. The infected root tissues were harvested 2 days post-inoculation and washed in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. Further, bacterial cells colonized on the root were collected, diluted in phosphate-buffered saline (PBS) buffer, and plated onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. After incubation at 37 &#176;C for 10 h, single colonies on LB plates were counted and normalized to determine the bacterial cells colonized on roots.
This method is highly applicable, has good repeatability, and is more suitable for accurate rhizosphere bacterial colonization determination.

Pleins feux sur l’auteur : Améliorer la colonisation des rhizobactéries sur les racines des plantes pour améliorer l’efficacité des engrais microbiens

Mesure de la colonisation bactérienne sur les racines d’Arabidopsis thaliana dans des conditions hydroponiques

Our research focuses on the interaction of beneficial rhizobacteria with plant roots. We are looking for the key mechanisms to enhance the colonization of beneficial bacteria, thus improving the efficiency and the stability of microbial fertilizers in the field. The methods for bacterial colonization of plant roots have been extensively studied, but there are still problems.For example, it's hard to measure the colonization on different sites distinctively, In the future we think applying microscope and high throughput counting will help to solve the problems. Our protocol is highly applicable with good repeatability, and it is more suitable for accurate rhizosphere bacteria colonization determination.

Pour tester la précision de la capacité de colonisation bactérienne détectée par cette méthode dans la rhizosphère d’A. thaliana, nous avons inoculé séparément Bacillus velezensis SQR9 WT et un mutant dérivé Δ8mcp dans la rhizosphère d’A . thaliana . Le Δ8mcp est un mutant qui n’a pas tous les gènes codant pour les chimiorécepteurs, et il a une colonisation significativement diminuée6. Nous avons mesuré leur colonisation 2 jours...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancing Rhizobacteria Colonization on Plant Roots for Improved Microbial Fertilizer Efficiency at JoVE.com

La colonisation des rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR) dans la rhizosphère est essentielle à son effet favorisant la croissance. Il est nécessaire d’uniformiser la méthode de détection de la colonisation de la rhizosphère bactérienne. Nous décrivons ici une méthode reproductible pour quantifier la colonisation bactérienne à la surface des racines.

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Nos recherches portent sur l’interaction des rhizobactéries bénéfiques avec les racines des plantes. Nous recherchons les mécanismes clés pour favoriser la colonisation des bactéries bénéfiques, améliorant ainsi l’efficacité et la stabilité des engrais microbiens sur le terrain. Les méthodes de colonisation bactérienne des racines des plantes ont été largement étudiées, mais il reste encore des problèmes.Par exemple, il est difficile de mesurer distinctement la colonisation sur différents sites, à l’avenir, nous pensons que l’application d’un microscope et d’un comptage à haut débit aidera à résoudre les problèmes. Notre protocole est très applicable avec une bonne répétabilité, et il est plus adapté à la détermination précise de la colonisation des bactéries de la rhizosphère.

measuring-bacterial-colonization-on-arabidopsis-thaliana-roots

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

451 vues.  Chinese Academy of Agricultural Sciences. Nos recherches portent sur l’interaction des rhizobactéries bénéfiques avec les racines des plantes. Nous recherchons les mécanismes clés pour favoriser la colonisation des bactéries bénéfiques, améliorant ainsi l’efficacité et la stabilité des engrais microbiens sur le terrain. Les méthodes de colonisation bactérienne des racines des plantes ont été largement étudiées, mais il reste encore des problèmes.Par exemple, il est difficile de mesurer distinctement la co...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Améliorer la colonisation des rhizobactéries sur les racines des plantes pour améliorer l’efficacité des engrais microbiens

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.

Recherche

Environnement

Hydroponic Cultivation of Arabidopsis thaliana Seedlings for Bacterial Inoculations

Culture hydroponique de plants d’Arabidopsis thaliana pour les inoculations bactériennes

Optimizing Bacillus velezensis Cultivation and Inoculation for Arabidopsis thaliana Seedling Growth Enhancement

Optimisation de la culture et de l’inoculation de Bacillus velezensis pour l’amélioration de la croissance des semis d’Arabidopsis thaliana