We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.

1. matériel végétal, conditions de croissance, et végétative Clonage Remarque: Trois populations de tuberculée ont été étudiées dans cette recherche: MCR (du comté de McLean, IL), ACR (du comté de Adams, IL), et le WCS (du comté de Wayne, IL) (Tableau 1). <ol><li> Recueillir et suspendre graines de tuberculée dans agar L -1 0,1 g: une solution d&#39;eau à 4 ° C pendant au moins 30 jours pour améliorer la germination. Remarque: Certaines populations de tuberculée sont en dormance, mais cette étape aide à surmonter la dormance et que les graines germent plus uniformément. </li><li> Germer des graines de chaque population de tuberculée (comme dans le tableau 1) dans 12 x 12 cm de plateaux contenant un milieu de mise en pot dans la serre. <ol><li> Maintenir des conditions de serre à 28/22 ° C des températures jour / de nuit dans une photopériode 16/8 h 12. </li><li> Supplément lumière naturelle dans la serre avec la lumière de lampes aux halogénures de mercure de fournir un minimum de 500 pmol m -2 </sup&gt; sec -1 flux de photons au niveau du couvert végétal. </li></ol></li><li> Transplant plantules quand ils sont 2 cm en 80 cm 3 pots dans la serre. </li><li> Les jeunes plants dans 950 cm 3 pots contenant un mélange 3: 1 de terreau:: 1: 1 de sol: tourbe: sable lorsque les plantules sont 4 cm de hauteur. Ajouter 5 g de granules à libération lente d&#39;engrais à chaque pot et mélanger avec ce mélange de sol. </li><li> Couper et enlever le méristème apical de la contenant les trois plus jeunes feuilles à partir de 7 cm de grandes plantes pour éliminer la dominance apicale. Remarque: Cette étape garantit que chaque plante se développera assez pousses 3 cm axillaires à cloner. </li><li> Accise cinq pousses axillaires (3 cm de longueur) lorsque les plantules sont environ 14 cm de haut à partir de chaque population tuberculée (comme dans le tableau 1). Retirer la majorité des feuilles sur ces pousses axillaires pour diminuer la perte d&#39;eau sur une manipulation, mais de conserver les deux feuilles les plus jeunes à la poursuite de la croissance sur la transplantation. <br/&gt; Remarque: Manipuler avec soin et essayer de ne pas endommager les pousses lorsque vous retirez les feuilles. Étiqueter chaque plante avec un jeu. </li><li> Transplant pousses axillaires en 80 cm 3 pots (un semis par pot) dans du terreau, qui est le même milieu utilisé pour la germination. Terreau doit être saturé initialement jusqu&#39;au racines forme dans la chambre de croissance, puis de maintenir l&#39;humidité et de placer des pots constante dans la chambre de croissance pendant 7 jours pour établir des racines. Remarque: Les plantes sont très sensibles à ce point et ne devraient pas être souligné. <ol><li> Maintenir des conditions de la chambre de croissance à 28/22 ° C des températures jour / de nuit dans une photopériode 16/8 h 12. </li><li> Une combinaison de incandescentes et fluorescentes ampoules peut être utilisé pour fournir de la lumière dans la chambre de croissance et devrait livrer au moins 550 pmol m -2 s -1 flux de photons à l&#39;usine de niveau du couvert 12. </li></ol></li><li> Transplant nouveau dans 950 cm 3 pots (un semis par pot) contenant un mélange 3: 1 de terreau:: 1: 1 de sol: la tourbe: sable (également inclure 5 g granules à libération lente d&#39;engrais) lorsque les plantes sont clonés 4 cm de hauteur, puis transfert à l&#39;effet de serre. </li><li> Cloner les plantes une deuxième fois en utilisant la même méthode décrite ci-dessus (par exemple, des mesures répétées de 1,5 à 1,8, puis passez à l&#39;étape 2.1). Pour une étude typique temps-sûr, générer des clones à partir d&#39;au moins six usines indépendantes de chaque population de tuberculée et les enregistrer sous forme de lignes MCR 1-6, 1-6 et ACR WCS 1-6. <ol><li> Établir au moins six «parent» lignées clonales distinctes afin de répéter l&#39;expérience et adéquatement représenter la variabilité génétique au sein de chaque population tuberculée. </li><li> Selon le nombre de points de temps seront analysés, générer suffisamment de sous-clones de chaque &quot;parent&quot; lignée clonale de mener une étude de temps bien sûr. </li></ol></li></ol> 2. Mener une étude du métabolisme avec excisés Waterhemp Feuilles <ol><li> Exciser les tiers-feuilles les plus jeunes (2 à 3 cm de longueur; inclure 0,5 cm de pétiole attaché) lorsque les plants de tuberculée clonés sont de 10 à 12 cm de hauteur pour le métabolisme de l&#39;herbicide et DT 50 analyse. </li><li> Pétioles des feuilles de couper de chaque usine de tuberculée un second temps (veiller à ce que 0,3 cm de pétiole reste) sous l&#39;eau, et de placer ces extrémités coupées dans 1,5 ml des flacons en plastique (une feuille par flacon) 15. REMARQUE: La coupe une deuxième fois sous l&#39;eau empêche les bulles d&#39;air de se former et de brancher vaisseaux du bois. <ol><li> Tout d&#39;abord, immerger partiellement les feuilles excisées avec pétiole de coupe dans un tampon de pré-incubation (200 pi) de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6) pendant 1 heure. </li><li> Deuxièmement, déplacer chaque feuille d&#39;un nouveau 1,5 ml flacon contenant un tampon d&#39;incubation (200 pi) de 0,1 M Tris-HCl (pH 6) plus 150 um [URL- 14 C] herbicide, et incuber à 28 ° C pendant 1 heure pour permettre une absorption de l&#39;herbicide dans les feuilles. Remarque: Les 14 et C-mésotrione <sjusqu&#39;à&gt; 14 C-primisulfuron-méthyl ont été utilisés dans nos études à des activités spécifiques d&#39;environ 20 mCi mmol -1. Tant diffusion et l&#39;adoption à travers le flux de transpiration xylème contribuent à la quantité d&#39;herbicide pris par feuille. Remarque: L&#39;effet des inhibiteurs métaboliques sur le métabolisme herbicide peut être déterminée en modifiant étapes 2.2.1 et 2.2.2 ci-dessus. Ajouter 100 uM de l&#39;inhibiteur dans le tampon de pré-incubation et laisser incuber pendant 2 h, puis à transférer le tampon d&#39;incubation avec l&#39;herbicide et inhibiteur de nouveau ajouter 100 uM. Par exemple, le malathion et tetcyclacis inhibent certaines activités du cytochrome P450 dans les usines 15-17. </li><li> Laver la partie immergée de feuilles excisées avec de l&#39;eau déminéralisée et transférer feuilles excisées à un quart de Murashige et Skoog (MS) une solution de sels (500 pi) de 0 h, 5 h, 11 h, 23 h ou 35 h, respectivement, dans la chambre de croissance pour l&#39;étude du métabolisme du temps bien sûr. </li></ol></li><li> Récolte en enlevant congés à partir de la solution d&#39;incubation à l&#39;instant approprié et moudre manuellement chaque tissu de la feuille dans de l&#39;azote liquide en utilisant un tube en polypropylene (15 ml) et d&#39;un pilon en verre. </li><li> Extrait herbicide radiomarqué et ses métabolites à partir de chaque feuille avec 7 ml d&#39;acétone à 90% avec un homogénéisateur de tissu de laboratoire dans le même tube de polypropylene ci-dessus. Rincer homogénéisateur de tissu avec un 7 ml supplémentaires d&#39;acétone à 90%, et de continuer à homogénéiser jusqu&#39;à tissu est complètement pulvérisé (habituellement environ 2 min). Note: 90% d&#39;acétone peut être utilisé pour l&#39;extraction de la plupart des herbicides de tissus végétaux. Cependant, si cette méthode est incapable d&#39;extraire plus de 90% des composés radiomarqués absorbés, puis 90% de methanol 90% d&#39;acétonitrile ou peuvent être substitués en tant que solvant d&#39;extraction. </li><li> Étiquette 90% d&#39;extraits d&#39;acétone (14 ml au total) et conserver à -4 ° C pendant 16 heures pour permettre l&#39;extraction supplémentaire de se produire. Remarque: Après cette extraction de feuilles traitées, la quantité de rad extractibleioactivity est typiquement d&#39;au moins 98% de composés radiomarqués absorbés par le feuille traitée. La radioactivité non extractible (résidus liés) dans les feuilles excisées en moyenne que de 0,3% dans tous les points de temps dans notre étude précédente 12, mais ce montant peut varier en fonction de l&#39;herbicide utilisé et le point de temps examiné. </li><li> Centrifuger les échantillons à 5000 g pendant 10 min et se concentrer surnageants à 40 ° C avec un évaporateur rotatif jusqu&#39;à un volume final de 0,5 ml est obtenue. Transférer ce volume dans un tube en plastique de 2,0 ml. </li><li> Ajouter acétonitrile: eau (1: 1 en volume) pour régler le volume final de l&#39;extraits de plantes pour 1,25 ml et re-centrifuger à 10 000 g pendant 10 min pour éliminer toutes les particules. </li><li> Mesurer la radioactivité totale dans une fraction aliquote de chaque échantillon pris (dpm pi -1) par spectroscopie de scintillation liquide (LSS) 12 et normaliser les quantités de [marqué au 14 C] des composés injectés pour analyse par HPLC (par exemple, 10,000 total DPM / échantillon / run) afin axes y sera uniforme parmi les échantillons pour la représentation graphique des résultats. </li></ol> 3. Analyse par HPLC de l&#39;herbicide Métabolisme dans les feuilles excisées Remarque: Résoudre radioactivité extractible totale dans herbicides mère et herbicides métabolites en utilisant les conditions de RP-HPLC 12 suivants. <ol><li> Effectuer une RP-HPLC avec une colonne C18 (4,6 x 250 mm, 5 um taille de particule pour HPLC analytique) à un débit de 1 ml min -1 pour la plupart des herbicides non polaires. Remarque: les colonnes C 4 ou C 12 de RP-HPLC peuvent également être utilisés pour optimiser la séparation de l&#39;herbicide du type parent à partir de ses métabolites. Un filtre de pré-colonne et / ou une colonne de garde peuvent également être utilisés pour protéger et prolonger la durée de vie de la colonne de RP. <ol><li> Utilisation suivant la phase mobile pour CLHP-PI: Eluant A, 0,1% d&#39;acide formique (v / v) dans l&#39;eau et l&#39;éluant B 100% d&#39;acétonitrile de qualité HPLC. Remarque: methanol de qualité HPLC peut également être utilisé comme Eluent B pour résoudre plusieurs composés polaires et les métabolites, mais être conscient que les temps de rétention peuvent aussi changer. Remarque: Le profil d&#39;élution utilisé pour résoudre mésotrione ou primisulfuron-méthyl de leurs métabolites polaires dans notre recherche 12 est: Étape 1, A: B (4: 1, v / v) à A: B (3: 2, v / v ) dans un gradient linéaire (12 min); Etape 2, A: B (3: 2, v / v) à A: B (3: 7, v / v) dans un gradient linéaire (5 min); Étape 3, A: B (3: 7, v / v) à A: B (1: 9, v / v) dans un gradient linéaire de 2 min (comprenant un total de 19 min). Remarque: Il peut être nécessaire d&#39;ajuster en fonction des propriétés physiques de la matière mère afin d&#39;optimiser la résolution des dégradés et des étapes isocratiques. </li><li> Suivre les étapes de gradient linéaire ci-dessus avec A: B (1: 9, v / v) à A: B (4: 1, v / v) dans un gradient linéaire (3 min) et A: B (4: 1, v / v) l&#39;étape isocratique (pendant au moins 2 min) pour rééquilibrer la colonne de RP avant d&#39;injecter le prochain extrait 12. </li></ol></li><li> Détecter et visualiser des composés marqués avec un débit SCINTIAnalyseur llation. Enregistrer la quantité d&#39;herbicide-mère restant dans chaque échantillon en tant que pourcentage de la radioactivité totale dans chaque échantillon (détectés et quantifiés par la scintillation de l&#39;analyseur de flux selon les instructions du fabricant) pour déterminer les taux du métabolisme herbicide dans chaque population ayant une tuberculée au cours du temps. </li></ol> 4. Procédures statistiques <ol><li> Organiser des soins dans une conception complètement randomisé (ou autre dispositif approprié pour l&#39;analyse statistique). </li><li> Effectuer deux expériences indépendantes avec chaque traitement, composé de trois répétitions biologiques pour chaque expérience. Les deux expériences indépendantes comprennent six réplicats biologiques au total. Si l&#39;effet de l&#39;expérience est non significative (α = 0,05), de combiner et d&#39;analyser les données de l&#39;expérience indépendante. Si l&#39;effet de l&#39;expérience est importante, puis d&#39;analyser séparément chaque expérience. Nota: Inclure les trois premières répétitions biologiques in Expérience 1 et les trois prochaines répétitions biologiques dans l&#39;expérience 2. Chaque réplique biologique représente un «parent» distincte lignée clonale provenant de chaque population (MCR 1-6, 1-6 ACR, et le WCS 1-6) de sorte que chaque Time- analyse de cours utilise des plantes génétiquement identiques. Les deux expériences indépendantes comprennent six réplicats biologiques au total, ce qui permet une représentation adéquate de la variabilité génétique et la détermination d&#39;une médiane de 50 DT pour chaque population tuberculée. </li><li> Analyser les données avec une analyse non linéaire des moindres carrés de régression et de les adapter à une courbe simple de premier ordre afin d&#39;estimer DT 50 s. L&#39;équation ci-dessous décrit le modèle: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li> où dans ce modèle Y représente le pourcentage de l&#39;herbicide du parent restant au temps t, μ i est la DT 50 pour chaquepopulation tuberculée i, et le paramètre C 0 est le montant estimé de parent herbicide présent à t = 0 12. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

La méthode excisé feuilles décrit ici a déjà été utilisé dans la recherche métabolisme primisulfuron en feuilles de maïs 15, mais nos résultats démontrent que ce protocole est également efficace, précis et reproductible pour mesurer le métabolisme de l&#39;herbicide dans une espèce de mauvaises herbes dicotylédones 12. Un avantage majeur de la technique de la feuille excisée par rapport aux études plante entière qui est une feuille excisée est indépendante de motifs de translo...

La résistance aux herbicides chez les mauvaises herbes présente une grave menace pour la production mondiale de nourriture et de fibres 1,2. Actuellement, des milliers de populations résistantes et de biotypes de plus d&#39;une centaine espèces de mauvaises herbes dans le monde entier ont été documentés et étudiés 3. Un mécanisme majeur qui confère une résistance aux herbicides dans des plantes est l&#39;altération herbicide de gènes et de protéines à un site cible, y compris des mutations génétiques qui affectent la cinétique ou l&#39;amplification du gène de site de liaison cible herbicide 2-protéine. Désintoxication métabolique grâce à des activités élevées de la cytochrome P450 monooxygénase (P450) ou le glutathion S -transferase (TPS) enzymes est un autre mécanisme qui confère une résistance aux herbicides chez les mauvaises herbes, qui est distinct de plusieurs façons de mécanismes fondés sur-site cible 2. La résistance en fonction métabolique a des ramifications importantes pour savoir si les coûts de remise en forme de la plante (aka pénalités de remise en forme) peuvent entraîner des mechanis résistance aux herbicidesm, ainsi que sur le potentiel d&#39;un mécanisme unique de désintoxication pour conférer une résistance croisée ou plusieurs herbicides dans les populations de mauvaises herbes 1,2,4. En général, le métabolisme de l&#39;herbicide dans les plantes peut être divisé en trois phases distinctes 5. Phase I implique la conversion d&#39;herbicide ou d&#39;activation tel que P450 hydroxylation de noyaux aromatiques ou des groupes alkyle, ou par N - réactions de désalkylation ou o-, ce qui augmente la polarité et de l&#39;herbicide 5,6 partiel désintoxication. Nouvellement introduit des groupes fonctionnels dans la Phase I peuvent fournir des sites de liaison pour la conjugaison au glutathion réduit par GST ou en glucose par glycosyltransférases dépendants UDP dans la phase II de 5,7. Par exemple, le principal métabolite initial de primisulfuron-méthyle dans le maïs est un groupe hydroxy-primisulfuron-méthyl 8, qui peut être métabolisé en hydroxy-primisulfuron-glucoside (Phase II) et ensuite transporté vers la vacuole pour le stockage à long terme ou encore métabolique pro5,6 transformation (phase III). Tuberculée (Amaranthus tuberculatus) est une tâche difficile à contrôler, les espèces de dicotylédones annuelles de mauvaises herbes qui entrave la production de maïs (Zea mays), le soja (Glycine max) et le coton (Gossypium hirsutum) aux États-Unis. Le degré élevé de diversité génétique des tuberculée est facilitée par sa biologie dioïque et longue distance pollinisation par le vent, et un plant femelle unique tuberculée peut produire jusqu&#39;à un million de graines 9. Ces graines sont petites et se propager facilement, qui lui confèrent naturellement tuberculée avec un mécanisme de dispersion efficace. Tuberculée affiche la germination continue tout au long de la saison de croissance 9, et ses graines sont capables de germer après plusieurs années d&#39;inactivité. Tuberculée est une plante C 4 qui possède un taux de croissance plus élevé que la plupart des mauvaises herbes à feuilles larges dans les systèmes de culture arables 10. En outre, de nombreuses populations de tuberculée sont résistants à la fam multiplesilles d&#39;herbicides 3. Une population de tuberculée (désigné MCR) de l&#39;Illinois est résistant à la 4-hydroxy-phénylpyruvate dioxygénase (HPPD) herbicides inhibant 11, tels que la mésotrione, ainsi que pour l&#39;atrazine et acétolactate synthase (ALS) herbicides inhibant, y compris primisulfuron-méthyl , en raison de la non-cible site mécanismes fondés 12,13. Une population différente de tuberculée désigné ACR 14, qui est résistant primisulfuron-méthyl-(en raison d&#39;une mutation dans le gène ALS) et de l&#39;atrazine résistantes mais sensibles à la mésotrione, et une population de tuberculée désigné WCS 14 qui est sensible au primisulfuron-méthyle, mésotrione, et l&#39;atrazine ont été utilisés en comparaison avec MCR dans notre recherche avant 12 et les expériences en cours (résumés dans le tableau 1). Des études initiales ne pas détecter des altérations dans les niveaux de la séquence de gène de l&#39;HPPD ou d&#39;expression, ou l&#39;absorption de la mésotrione réduit, dans le MCRpopulation par rapport aux populations de mésotrione sensible 12. Cependant, les études de métabolisme avec des plantes entières ont démontré des niveaux significativement plus faibles de l&#39;herbicide parent de mésotrione dans MCR par rapport à l&#39;ACR et le WCS, qui en corrélation avec les réponses phénotypiques précédentes pour mésotrione 11,12. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tuberculée population </td><td> Abréviation </td><td> Phénotype à Mésotrione </td><td> Mécanisme Résistance Mésotrione </td><td> Phénotype de Primisulfuron </td><td> Mécanisme Résistance Primisulfuron </td></tr><tr><td> Comté de McLean-résistant </td><td> MCR </td><td> Résistant </td><td> Métabolisme * </td><td> Résistant </td><td> Métabolisme </td></tr><tr><td> Adams County résistant </td><td> ACR </td><td> Sensitive </td><td> - </td><td> Résistant </td><td> Mutation cible place dans la SLA 14 </td></tr><tr><td> Wayne County-Sensitive </td><td> WCS </td><td> Sensible </td><td> - </td><td> Sensible </td><td> - </td></tr></tbody></table> * Mécanismes de résistance non-target-site, autres que métabolisme accru, peuvent également conférer à la population MCR 12 résistance à la mésotrione. Tableau 1: description des populations de tuberculée de Illinois utilisés dans cette étude. En plus de déterminer les taux de métabolisme de l&#39;herbicide dans les semis de tuberculée intactes, une approche expérimentale différente a été développée et utilisée dans notre étude précédente pour étudier le métabolisme en utilisant un tuberculée test sur ​​feuilles excisées 12 ainsi que divers inhibiteurs du cytochrome P450 (par exemple, tetcyclacis et malathion). Cette méthode a été adaptée spécifiquement pour tuberculée d&#39;un PREVIous enquête du métabolisme du primisulfuron-méthyl dans le maïs excisé laisse 15, depuis le test de la feuille excisée n&#39;a pas encore été signalé pour mener des recherches sur le métabolisme de l&#39;herbicide dans une usine de dicotylédones. L&#39;insecticide malathion organophophosate a été fréquemment utilisé pour in vivo et dans la recherche herbicides métabolisme in vitro pour indiquer la participation de 16 P450. Par exemple, la tolérance et le métabolisme rapide de la mésotrione dans le maïs sont dues à P450 catalysée par hydroxylation de l&#39;anneau, qui a été vérifiée lorsque le malathion sensibilité accrue du maïs pour la mésotrione 17. De même, le malathion a inhibé le métabolisme de l&#39;Inhibiteur de l&#39;ALS primisulfuron-méthyl dans le maïs excisé laisse 15. Un avantage majeur de la technique de la feuille excisée est que les données générées sont indépendantes de motifs de translocation de plantes entières, un facteur important à considérer lors de l&#39;évaluation du métabolisme systémique, herbicides de postlevée dans les plantes. En conséquence, cette méthode permet quantitative etanalyse métabolique qualitative de se concentrer sur une seule feuille traitée 12. Une stratégie de clonage végétative, en combinaison avec le protocole de la feuille excisée, a déjà été utilisé dans tuberculée de mener des études sur le métabolisme 12. En raison de la nature de la pollinisation croisée tuberculée (séparés pour les hommes et les plantes femelles), et un grand degré de diversité génétique au sein des espèces d&#39;Amaranthus dioïque 9, ce protocole a assuré que les semis de tuberculée génétiquement identiques ont été analysés dans les expériences de temps bien sûr. Cet article démontre l&#39;utilité de la méthode de la feuille excisée pour mesurer les taux de métabolisme de l&#39;herbicide dans une mauvaise herbe dicotylédone (de tuberculée). La quantité d&#39;herbicide parent restant a été déterminée à chaque point (figure 1) de temps en moins l&#39;analyse des carrés de régression non linéaire, et a été en forme avec une courbe simple de premier ordre afin d&#39;estimer le temps pour 50% d&#39;herbicide absorbé à se dégrader ( DT 50). Représentantchromatogrammes de chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) sont affichés pour la SLA-résistants et les populations de tuberculée -sensibles, qui indiquent la disparition de l&#39;herbicide mère et la formation concomitante de métabolite (s) polaire à une étude des temps bien sûr (Figure 2). L&#39;objectif de notre article est de décrire et de démontrer l&#39;utilité de l&#39;analyse de la feuille excisée en combinaison avec une méthode de clonage végétal pour déterminer les taux précis et reproductibles du métabolisme des herbicides dans les plantes dicotylédones, en utilisant uniformément anneau marqué (URL- 14 C) herbicides trois populations de tuberculée qui diffèrent dans leurs réponses de plantes entières à HPPD- et herbicides inhibant l&#39;ALS (tableau 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>for pre-germinating seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting medium</td>
			<td>Sun Gro Horticulture</td>
			<td>49040233</td>
			<td>for plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutricote</td>
			<td>Agrivert&#160;</td>
			<td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td>
			<td>slow-release fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber E15</td>
			<td>Controlled Environments Limited</td>
			<td>20207</td>
			<td>plant culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>buffer for excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (concentrated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144500</td>
			<td>adjust pH of buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) salts&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0404</td>
			<td>incubation of excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>leaf washes after incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>plant extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (HPLC grade)</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>MKH07610</td>
			<td>HPLC mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt Analytical</td>
			<td>MK259205</td>
			<td>acidify mobile phase pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>1.5 or 2.0 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (temperature controlled)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>15 or 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#220;CHI</td>
			<td>R200</td>
			<td>concentrate plant samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation spectrometry (LSS)</td>
			<td>Packard Instruments</td>
			<td>104470</td>
			<td>quantify 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N2910401</td>
			<td>resolve herbicide metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow scintillation analyzer&#160;</td>
			<td>LabLogic System</td>
			<td>1103303</td>
			<td>for HPLC analysis of 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column&#160;</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>03-050-522&#160;</td>
			<td>reversed phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo M cocktail</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013579</td>
			<td>for Flow-scintillation analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18</td>
			<td>for LSS; biodegradable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>CH-6010&#160;</td>
			<td>homogenize leaf samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring rates of herbicide metabolism in dicot weeds with an excised leaf assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

Les grandes différences dans les taux de métabolisme de la mésotrione ont été détectés entre soit WCS ou ACR et MCR (Figure 1). A chaque point de temps, MCR a métabolisé mésotrione plus rapidement que les deux populations de mésotrione sensible, WCS et ACR, qui est en corrélation avec plante entière phénotypiques réponses précédentes 11. En clonant suffisamment de plantes d&#39;une plante parentale unique à partir de chaque population, analyses temps de cours métabolisme de...

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Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Mesurer les taux de métabolisme dans l&#39;herbicide Mauvaises herbes dicotylédones avec un dosage excisés Feuille

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

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Research

JoVE Journal

Environment

11.9K vues.  University of Illinois. This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

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Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Mesurer les flux d&#39;éléments nutritifs et des substances toxiques minéraux dans les usines avec Traceurs radioactifs

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Recherche

Environnement

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Protocoles pour les essais la résistance aux herbicides robuste chez différentes espèces de mauvaises herbes

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

LC-MS Analyse des plaquettes humaines en tant que plate-forme pour l&#39;étude du métabolisme mitochondrial

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Laboratory and Field Protocol for Estimating Sheet Erosion Rates from Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to severe environmental impacts. The understanding of sheet erosion is, consequently, a worldwide issue with implications for both environment and economies. However, the knowledge on how erosion evolves in space and time is still limited, as well as its effects on the environment. Below, we explain a new dendrogeomorphological protocol for deriving eroded soil thickness (Ex) by acquiring accurate microtopographic data using both terrestrial laser scanning (TLS) and microtopographic profile gauges. Additionally, standard dendrogeomorphic procedures, dependent on anatomical variations in root rings, are utilized to establish the timing of exposure. Both TLS and microtopographic profile gauges are used to obtain ground surface pro&#64257;les, from which Ex is estimated after the threshold distance (TD) is determined, i.e., the distance between the root and the sediment knickpoint, which allows de&#64257;ning the lowering of the ground surface caused by sheet erosion. For each profile, we measured the height between the topside of the root and a virtual plane tangential to the ground surface. In this way, we intended to avoid small-scale impacts of soil deformation, which may be due to pressures exerted by the root system, or by the arrangement of exposed roots. This may provoke small amounts of soil sedimentation or erosion depending on how they physically affect the surface runoff. We demonstrate that an adequate microtopographic characterization of exposed roots and their associated ground surface is very valuable to obtain accurate erosion rates. This finding could be utilized to develop the best management practices designed to eventually halt or perhaps, at least, lessen soil erosion, so that more sustainable management policies can be put into practice.

Characterizing erosion from dendrogeomorphology has usually focused on accurately finding the starting time of root exposure, by examining macroscopic or cell level changes caused by exposure. Here, we offer a detailed description of different novel techniques to obtain more precise erosion rates from highly accurate microtopographic data.

Laboratoire et au champ protocole pour estimer les taux d’érosion de feuille de Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to ...

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to bacteria control the amount that will accumulate in staple food crops. The bioavailability of these metals is dependent on their speciation in solution, but more particularly under anoxic conditions where Hg is methylated to toxic monomethylmercury (MeHg) and Cd persists in the rhizosphere. Whole-cell microbial biosensors give a quantifiable signal when a metal enters the cytosol and therefore are useful tools to assess metal bioavailability. Unfortunately, most biosensing efforts have so far been constrained to oxic environments due to the limited ability of existing reporter proteins to function in the absence of oxygen. In this study, we present our effort to develop and optimize a whole-cell biosensor assay capable of functioning anaerobically that can detect metals under anoxic condition in quasi-real time and within hours. We describe how the biosensor can help assess how chemical variables relevant to the environmental cycling of metals affect their bioavailability. The following protocol includes methods to (1) prepare Hg and Cd standards under anoxic conditions, (2) prepare the biosensor in the absence of oxygen, (3) design and execute an experiment to determine how a series of variable affects Hg or Cd bioavailability, and (4) to quantify and interpret biosensor data. We show the linear ranges of the biosensors and provide examples showing the method's ability to distinguish between metal bioavailability and toxicity by utilizing both metal-inducible and constitutive strains.

Here, we present a protocol to use an anaerobic whole-cell microbial biosensor to evaluate how different environmental variables affect the bioavailability of Hg and Cd to bacteria in anoxic environments.

Un dosage anaérobie biocapteurs pour la détection du mercure et du Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has become particularly relevant for assessing the anthropogenic-altered global nitrogen cycle and the emission of greenhouse gases (i.e., N2O). Several methods are available for measuring denitrification, but none of them are completely satisfactory. Problems with existing methods include their insufficient sensitivity, and the need to modify the substrate levels or alter the physical configuration of the process using disturbed samples.This work describes a method for estimating sediment denitrification rates that combines coring, acetylene inhibition, and microsensor measurements of the accumulated N2O. The main advantages of this method are a low disturbance of the sediment structure and the collection of a continuous record of N2O accumulation; these enable estimates of reliable denitrification rates with minimum values up to 0.4-1 &#181;mol N2O m-2 h-1. The ability to manipulate key factors is an additional advantage for obtaining experimental insights. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate. The method is appropriate for estimating denitrification rates in any aquatic system with retrievable sediment cores. If the N2O concentration is above the detection limit of the sensor, the acetylene inhibition step can be omitted to estimate the N2O emission instead of denitrification. We show how to estimate both actual and potential denitrification rates by increasing nitrate availability as well as the temperature dependence of the process. We illustrate the procedure using mountain lake sediments and discuss the advantages and weaknesses of the technique compared to other methods. This method can be modified for particular purposes; for instance, it can be combined with 15N tracers to assess nitrification and denitrification or field in situ measurements of denitrification rates.

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

This method estimates sediment denitrification rates in sediment cores using the acetylene inhibition technique and microsensor measurements of the accumulated N2O. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate.

Estimation des taux de dénitrification de sédiments à l’aide de carottes et N2O microcapteurs

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and shape of activated sludge flocs can indicate the conditions at the microscale, and also directly affect how well the sludge settles in a clarifier.
Particle size and shape are both misleadingly &#39;simple&#39; measurements. Many subtle issues, often unaddressed in informal protocols, can arise when sampling, imaging, and analyzing particles. Sampling methods may be biased or not provide enough statistical power. The samples themselves may be poorly preserved or undergo alteration during immobilization. Images may not be of sufficient quality; overlapping particles, depth of field, magnification level, and various noise can all produce poor results. Poorly specified analysis can introduce bias, such as that produced by manual image thresholding and segmentation.
Affordability and throughput are desirable alongside reproducibility. An affordable, high throughput method can enable more frequent particle measurement, producing many images containing thousands of particles. A method that uses inexpensive reagents, a common dissecting microscope, and freely-available open source analysis software allows repeatable, accessible, reproducible, and partially-automated experimental results. Further, the product of such a method can be well-formatted, well-defined, and easily understood by data analysis software, easing both within-lab analyses and data sharing between labs.
We present a protocol that details the steps needed to produce such a product, including: sampling, sample preparation and immobilization in agar, digital image acquisition, digital image analysis, and examples of experiment-specific figure generation from the analysis results. We have also included an open-source data analysis pipeline to support this protocol.

The size and shape of particles in activated sludge are important parameters that are measured using varying methods. Inaccuracies arise from non-representative sampling, suboptimal images, and subjective analysis parameters. To minimize these errors and ease measurement, we present a protocol specifying every step, including an open source software pipeline.

Mesurer la forme et la taille des particules de boues activées immobilisées dans la gélose avec un Pipeline de logiciels Open Source

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

Culture de microalgues vertes en bulle colonne photobioréacteurs et un dosage des lipides neutres

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Estimation de l'indice de la zone des feuilles à l'aide de trois méthodes distinctes dans les peuplements à feuilles caduques pures

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a non-targeted approach, plant metabolites and xenobiotics of interest are identified and localized in plant tissues to uncover&#160;specific distribution patterns. Then, in silico prediction of potential metabolites (i.e., catabolites and conjugates) from the identified xenobiotics is performed. When a xenobiotic metabolite is located in the tissue, the type of enzyme involved in its alteration by the plant is recorded. These results were used to describe different types of biological reactions occurring in S. alba leaves in response to xenobiotic accumulation in the leaves. The metabolites were predicted in two generations, allowing the documentation of successive biological reactions to transform xenobiotics in the leaf tissues.

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

This method uses mass spectrometry imaging (MSI) to understand metabolic processes in S. alba leaves when exposed to xenobiotics. The method allows the spatial localization of compounds of interest and their predicted metabolites within specific, intact tissues.

Étude du métabolisme des xénobiotiques dans les feuilles de Salix alba par imagerie par spectrométrie de masse

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a ...