La plupart des expériences étudient les interactions plantes-microbes en se concentrant sur la colonisation, mais notre protocole est conçu pour examiner à la fois la colonisation et le maintien des bactéries sur la racine. Nous pouvons changer l’expérience pour s’adapter à différentes bactéries et plantes, et nous pouvons même tester plusieurs bactéries dans chaque plaque de 24 puits. Pour commencer, utilisez un poinçonneur de trou standard pour créer des disques de maille en plastique.
Recueillir les disques dans un récipient en verre, et couvrir lâchement. Stériliser à l’aide d’un jeu d’autoclave sur un cycle sec de 20 minutes. Utilisez des pinces à épiler stérilisées par flamme pour distribuer environ 40 disques en maille stérilisés en une seule couche à la surface de la plaque d’agar moyenne de croissance végétale préparée précédemment.
Placer deux graines précédemment stérilisées au centre de chaque maille. Sceller l’assiette avec du ruban chirurgical, et incuber pendant deux à six jours à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pour vernaliser les graines. Ensuite, placez le côté agar de la plaque dans une chambre de croissance végétale pendant huit à dix jours sous des réglages de courte journée de neuf heures de lumière à 21 degrés Celsius et 15 heures d’obscurité à 18 degrés Celsius pour germer et faire pousser des semis.
Ajouter un millilitre de milieu de croissance bactérienne à chaque puits d’une plaque stérile de 24 puits. Pour transférer les semis germés enchâssés dans le maillage, utilisez des forceps stérilisés par flamme pour peler délicatement le maillage contenant deux semis germés, de taille égale et intacts, de haut en large de la plaque d’agar. Transférer un flotteur avec des semis à chaque puits de liquide de croissance bactérienne, côté racine vers le bas.
Ensuite, resuspendez les bactéries cultivées du jour au lendemain sur des plaques d’agar dans le milieu de croissance bactérienne liquide. Ajouter 10 microlitres de suspension bactérienne à chaque puits, à l’exception des puits de contrôle à base de médias seulement, pour une concentration finale d’un million d’unités de formation de colonies de bactéries par puits. Pour sceller la plaque pour une croissance stérile, pressez soigneusement le film perméable au gaz sur la plaque sans toucher le côté collant.
Appliquez une pression autour de chacun des anneaux fabriqués par les puits pour vous assurer que chaque puits a été scellé individuellement. Ensuite, fermez la plaque avec son couvercle en plastique confortablement sur le film perméable au gaz. Placer la plaque dans une chambre de croissance végétale sur un shaker de plaque orbitale réglé à 220 rpm, et incuber pendant 18 heures dans les mêmes conditions que les semis ont été germés à l’origine.
Pour rincer tous les flotteurs avec des plantes, ajouter un millilitre d’eau stérile à chaque puits d’une nouvelle plaque de 24 puits. Retirer le film perméable au gaz de la plaque avec les plantes, et utiliser des forceps stériles pour transférer les flotteurs vers les puits avec de l’eau, et incuber pendant 10 minutes à température ambiante sans agitation. Ensuite, remplissez chaque puits d’une nouvelle plaque de 24 puits d’un millilitre de milieu de croissance végétale.
Transférer un maillage à chaque puits et couvrir d’un joint perméable au gaz. Incuber pendant 72 heures sur le shaker orbital à 220 rpm dans la chambre de croissance des plantes. Après l’incubation, rincer les plantes comme auparavant.
Après le rinçage, retirer les semis du maillage en plaçant doucement des forceps stérilisés par flamme sous les feuilles du côté des feuilles du maillage. Pincez légèrement la tige et agitez les semis de haut en loin du maillage pour déloger la racine sans la casser. Pour éliminer les bactéries des racines des plantes, transférez les semis de chaque maille dans les puits individuels d’une plaque de sonication de 24 puits contenant un millilitre d’eau double distillée.
Sonicate tous les échantillons dans la plaque à la fois à l’aide d’un sonicateur à plusieurs volets tel que décrit dans le manuscrit. Pour quantifier les bactéries, effectuez des dilutions périodiques 10 fois des échantillons soniques dans le milieu de croissance bactérienne. Étendre à l’aide de perles de verre stériles et incuber à la température optimale pour les bactéries jusqu’à ce que les colonies individuelles soient dé countables.
Pour recueillir les racines intactes des plantes, utilisez des forceps pour enlever les semis du maillage. Ensuite, transférez chaque plante sur une lame de microscope en plaçant la pointe de la racine sur la lame et en la faisant glisser loin de la pointe pour régler la chasse d’eau avec la lame, assurant ainsi une racine redressée pour une meilleure imagerie. Ajoutez une goutte d’eau ou un milieu stérile de croissance végétale à chaque échantillon pour hydrater les interfaces entre les couvertures et les toboggans.
Placez un coverslip en verre juste au-dessus de la couronne de racine et sous les feuilles de pousse pour éviter l’inclinaison du coverslip, et appuyez doucement vers le bas. Ensuite, imagez les bactéries à l’aide de filtres d’excitation/émission appropriés pour différencier les bactéries les unes des autres et la racine des plantes. Pseudomonas simiae, bactérie naturellement fluorescente, a colonisé les racines d’Arabidopsis thaliana et a été maintenue sur la racine après transfert au milieu de croissance des plantes.
La couronne de racine, la mi-longueur, et la pointe montrent la fluorescence due à la colonisation de Pseudomonas simiae. Le contrôle négatif sans bactéries n’a montré aucune colonisation. Lorsque pseudomonas simiae sur les racines arabidopsis thaliana ont été quantifiés après 18 heures de colonisation ou 72 heures d’entretien, le nombre total d’unités de formation de colonies par semis à chaque point de temps a montré une bonne reproductibilité à travers les répliques biologiques effectuées à différents jours.
Il y a eu une augmentation du nombre d’unités formant des colonies par semis après 72 heures dans le milieu d’entretien, par rapport aux nombres observés au point de temps de 18 heures après la colonisation, ce qui indique que la croissance active des bactéries colonisées sur la racine de la plante s’est produite pendant l’étape d’entretien. Trois espèces de bactéries isolées d’Arabidopsis thaliana cultivées en sol naturel dans des conditions de laboratoire ont été utilisées pour surveiller l’association de plusieurs espèces sur les racines des plantes. Ils ont été clairement différenciés sur les supports contenant X-gal en raison de différences dans la morphologie et la couleur des colonies, ce qui a permis de compter les unités de formation de colonies par semis de chaque espèce sans sélection d’antibiotiques, même en coculture multi-espèces.
Ces trois espèces de bactéries ont toutes été colonisées et maintenues sur la racine, que ce soit seule ou en coculture bactérienne. Chaque espèce a montré des tendances similaires selon différentes répliques biologiques et techniques, montrant que ce protocole peut être utilisé pour mesurer les unités relatives ou totales de formation de colonies par racine de chaque espèce. Lorsqu’elles sont cultivées seules, aucune espèce n’a montré d’augmentation substantielle de l’abondance au cours de l’étape d’entretien, mais l’ensemble des unités de formation de colonies par racine de la communauté combinée a augmenté dans les cocultures, ce qui indique que ces bactéries n’interdisent pas la colonisation des autres souches.
Les étapes les plus difficiles sont celles qui nécessitent l’enlèvement de plantes intactes des disques en maille. Être patient et doux rendra cela possible. Si les cellules bactériennes sont fluorescentes, les échantillons pourraient être triés par cytométrie d’écoulement pour déterminer le nombre relatif de cellules.
