Nous remercions Regina Piske pour son aide technique pour l’isolement de la microglie et le Dr Caio Andreta Figueiredo pour son aide pour l’acquisition d’images microscopiques dans la figure supplémentaire S1. Nous remercions l’installation FACS du MDC pour leur soutien technique. Ce manuscrit présente en partie les chiffres représentatifs soumis au Brain, Behavior and Immunity Journal en 2024. Les figures 1A, 2A et S3A supplémentaires ont été créées à l’aide de BioRender.com.

Une vue générale de la procédure expérimentale est illustrée graphiquement à la figure 1A. Toutes les expériences impliquant la manipulation d’animaux vivants ont été effectuées dans le strict respect de la loi allemande sur la protection des animaux et ont été approuvées par le Bureau régional de la santé et des services sociaux de Berlin (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Allemagne). Les souris ont été hébergées en groupe dans des cages ventilées dans des conditions de laboratoire standard avec un cycle lumière/obscurité de 12:12 h dans l’installation centrale pour animaux du Centre Max Delbrück de médecine moléculaire (MDC). De la nourriture et de l’eau ont été fournies à volonté. Voir le tableau 1 pour la composition des tampons et des réactifs et le tableau des matériaux pour les détails relatifs à tous les réactifs, instruments et matériaux utilisés dans ce protocole. Pour le test spécifique de vGLUT1, nous avons utilisé le terme in vivo* tout au long du manuscrit pour reconnaître que la cytométrie en flux nécessite une homogénéisation des tissus et un isolement cellulaire, et que les microglies présentent une viabilité d’environ 95 % après la procédure d’isolement (Figure 1B et Figure supplémentaire S1). Par conséquent, ils conservent leur capacité à engloutir le matériel synaptique ex vivo, pendant une courte période, jusqu’à la fixation. Ainsi, la quantification de la microglie vGLUT1+ comprend à la fois l’engloutissement in vivo et ex vivo à court terme jusqu’à l’étape de fixation.
1. Coloration intracellulaire vGLUT1 pour la détection de l’engloutissement in vivo* des synapses glutamatergiques par la microglie
REMARQUE : La procédure d’isolement cellulaire suivante est adaptée dela 16. Toutes les étapes de l’isolement cellulaire doivent être effectuées sur de la glace.
<ol><li>Anesthésier les souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de pentobarbital. Perfuser les souris par voie intracardique avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) glacée pendant ~2 min. REMARQUE : Une souris est utilisée par échantillon (n).</li>
	<li>Retirer le cerveau du crâne et le conserver dans 1 mL de milieu cellulaire neural. REMARQUE : Le milieu cellulaire neural, tel que le milieu Hibernate-A, est utilisé pour assurer une viabilité élevée des cellules après le processus de dissociation tissulaire.</li>
	<li>Transférez le cerveau dans une boîte de Pétri remplie de 1 ml de milieu cellulaire neural glacé et disséquez l’hippocampe comme décrit précédemment17.</li>
	<li>Transférez l’hippocampe dans un homogénéisateur Dounce rempli de 1 ml de milieu cellulaire neural et dissociez le tissu à l’aide du pilon lâche avec environ ~25 coups doux.</li>
	<li>Placez une passoire de 70 μm sur un tube de polypropylène de 5 ml et ajoutez 500 μL de milieu cellulaire neural. Transférez l’homogénat de tissu dans le tube de polypropylène de 5 mL à travers la passoire.</li>
	<li>Rincer l’homogénéisateur Dounce 2 fois avec 1 mL de milieu cellulaire neural froid et centrifuger les échantillons à 400 × g pendant 8 min.</li>
	<li>Aspirez le surnageant et remettez le granulé en suspension dans 500 μL de DPBS glacé par pipetage doux. Assurer une suspension homogène et compléter le volume final à 1,5 mL à l’aide de DPBS.</li>
	<li>Ajoutez 500 μL de solution isotonique de Percoll à l’échantillon, remettez-le doucement en suspension et recouvrez-le de 2 ml supplémentaires de DPBS froid.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 3 000 × g pendant 10 min avec une accélération maximale et sans frein. Aspirez la couche supérieure ainsi que le disque de myéline dans la phase intermédiaire. REMARQUE : Toutes les étapes de centrifugation suivantes sont effectuées à 4 oC sauf indication contraire.</li>
	<li>Ajouter 4 mL de DPBS froid et centrifuger les échantillons à 400 × g pendant 10 min. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 100 μL de solution de coloration de viabilité fixable et incuber les échantillons pendant 30 min à 4 °C.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de DPBS froid à l’échantillon et centrifuger les échantillons à 300 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et ajouter 100 μL de solution de coloration CD16/CD32 (1/200 dans un tampon FACS). Vortex pendant ~5 s et incubation pendant 10 min à 4 °C. REMARQUE : La coloration CD16/CD32 est un prétraitement visant à minimiser la liaison non spécifique des anticorps aux cellules porteuses de FcR, telles que la microglie, avant des applications telles que la cytométrie en flux.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon FACS à l’échantillon et centrifuger à 300 × g pendant 5 min. Aspirez le surnageant et ajoutez 100 μL de colorant master mix-I (1/100 anti-CD11b/ anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C/ anti-Ly6G dans 1x tampon FACS). Incuber les échantillons pendant 20 min à 4°C dans l’obscurité.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon FACS à l’échantillon et centrifuger à 300 × g pendant 5 min.</li>
	<li>Remettre le granulé en suspension dans 250 μL de tampon de fixation. Incuber à 4 °C pendant 25 min.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de tampon de perméabilisation (PERM) et centrifuger 300 × g pendant 5 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant et ajouter 100 μL de vGLUT1 ou de solution de coloration de contrôle des isotypes. Agiter pendant ~5 s et incuber les échantillons à 4 °C pendant 50 min.</li>
	<li>Ajouter 2 ml de 1 tampon PERM et centrifuger 300 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et ajouter 2 mL de tampon FACS aux échantillons.</li>
	<li>Centrifuger à 300 × g pendant 5 min et jeter le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans 250 μL de tampon FACS et faites passer les échantillons à travers un filtre à crépine de 40 μm.</li>
	<li>Analysez l’intensité de fluorescence de vGLUT1 à partir d’une microglie simple/viable/CD11b++/CD45+ à l’aide de la cytométrie en flux. Utilisez les macrophages de la rate comme contrôle négatif pour chaque expérience.<ol><li>Isolez les splénocytes en comprimant doucement le tissu de la rate haché à travers un filtre à crépine de 70 μm à deux reprises. Rincez les filtres avec 40 mL de DPBS et récupérez la suspension dans un tube conique de 50 mL.</li>
		<li>Centrifugez 350 × g pendant 10 min et remettez en suspension la pastille obtenue dans une solution de 1 mL de tampon de lyse des globules rouges. Incuber 10 min sur glace.</li>
		<li>Ajouter 10 mL de DPBS à l’échantillon après l’incubation et centrifuger à 350 × g pendant 10 min.</li>
		<li>Procédez aux étapes de coloration expliquées entre les étapes 1.11 et 1.17. REMARQUE : La stratégie de contrôle est fournie dans la figure supplémentaire S2 pour définir les macrophages de la rate comme CD11b ++/ CD45 ++/ Population cellulaire viable.</li>
		<li>Stratégie de contrôle (Figure 1)<ol><li>Porte primaire : ajustez la zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) [axe x] et la zone de diffusion latérale (SSC-A) [axe y] pour inclure la population de microglie dans la zone fermée et exclure les débris cellulaires.</li>
			<li>Ajustez la zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) [axe x] et la hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H) [axe y] pour exclure les doublets. Les maillots apparaissent en diagonale sur ce graphique à points.</li>
			<li>Ajustez CD11b-PECy7 [axe y] et CD45-APC [axe x] et fixez la population avec un niveau de surface élevé de CD11b et un niveau moyen de CD45 sous forme de microglie.</li>
			<li>Excluez les cellules mortes dans la porte négative FITC[axe y]. FACULTATIF : Excluez également les cellules qui sont positives pour Ly6C- et Ly6G-FITC dans la porte FITC-négative pour exclure les macrophages associés au SNC de l’analyse. REMARQUE : Contrairement aux cellules vivantes, les cellules mortes dont les membranes sont compromises permettent au colorant de viabilité fixable de pénétrer dans le cytoplasme, ce qui augmente la quantité de marquage protéique18. Ainsi, les cellules mortes seront plus brillantes que les cellules vivantes, qui sont incluses dans la porte définie.</li>
			<li>Ajustez CD45-APC [axe x] et vGLUT1-PE [axe y] ; la population qui se trouve au-dessus du seuil de contrôle, où aucun événement positif n’a été détecté dans l’échantillon de rate (contrôle biologique négatif interne, figure 1E) est considérée comme la fraction vGLUT1-positive dans l’échantillon.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Détection de l’engloutissement in vitro de synaptosomes bruts par la microglie
<ol><li>Préparation brute de synaptosomes et étiquetage rouge pHrodo REMARQUE : Toutes les étapes suivantes doivent se dérouler sur de la glace.<ol><li>Suivez les étapes 1.1 à 1.2.</li>
		<li>Transférez le cerveau dans une boîte de Pétri remplie de 1 ml de milieu cellulaire neural glacé et disséquez soigneusement l’hippocampe. Gardez toujours la boîte de Pétri sur de la glace. Utilisez l’hippocampe pour l’isolement de la microglie à l’étape suivante.</li>
		<li>Transférez le reste du cerveau (à l’exception du cervelet et du bulbe olfactif) dans un homogénéisateur Dounce rempli de 1 mL de réactif d’extraction de protéines synaptiques et dissociez doucement le tissu à l’aide du pilon lâche avec environ ~30 frappes. Compléter le comprimé d’inhibiteur de protéase par 10 mL de réactif d’extraction et isoler les synaptosomes selon les instructions du fabricant. REMARQUE : Les réactifs d’extraction de protéines synaptiques, tels que SynPER19, sont utilisés pour préparer des synaptosomes contenant des protéines pré- et postsynaptiques biologiquement actives.</li>
		<li>Dissoudre la pastille de synaptosome brute dans 500 μL d’une solution de CO3 0,1 M Na,2. Colorer l’échantillon de synaptosome avec 10 μL de 0,2 mM de pHrodo Red. Incuber les échantillons de synaptosomes bruts à température ambiante (24-25 °C) pendant 1,5 h en agitant doucement.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de DPBS froid sur l’échantillon, centrifuger pendant 1 min à pleine vitesse (20 815 × g) et aspirer le surnageant.</li>
		<li>Répétez l’étape 2.1.5 pour 7 fois au total afin d’éliminer l’excès de pHrodo Red non lié des échantillons.</li>
		<li>Après la dernière centrifugeuse, effectuez un test BCA standard pour quantifier les concentrations en protéines de l’échantillon.</li>
		<li>Facultatif : congélation instantanée d’échantillons de synaptosomes dans du DPBS avec 5 % de DMSO à l’aide d’azote liquide et conservation pendant 3 semaines à -80 °C. Couvrez les tubes avec du papier d’aluminium pour maintenir l’exposition à la lumière minimale.</li>
	</ol></li>
	<li>In vitro Essai d’engloutissement des synaptosomes bruts à l’aide d’une microglie adulte fraîchement isolée<ol><li>Préparez un LCR et équilibrez-le avec 95 % d’O2:5 % de CO2 pendant 30 min. REMARQUE : Pour les étapes 2.2.2 à 2.2.4, suivez les instructions du fabricant pour la préparation de la solution de digestion à base de papaïne.</li>
		<li>Ajouter 4 mL de LCRa dans le flacon 2 du kit de papaïne. Placez le flacon dans un bain-marie à 37 °C pendant ~10 min jusqu’à ce que la solution de papaïne apparaisse claire.</li>
		<li>Ajouter 400 μL d’aCSF dans le flacon 3 du kit de papaïne. Mélanger doucement pendant ~10 fois par pipetage lent.</li>
		<li>Ajouter 200 μL du flacon 3 au flacon 2 (reconstitué à l’étape 2.2.3). Conservez le reste de la fiole 3.</li>
		<li>Prenez l’hippocampe disséqué à l’étape 2.1.2 et émincez l’hippocampe disséqué à l’aide d’un scalpel.</li>
		<li>Transférez l’hippocampe haché dans un tube de dissociation tissulaire rempli de 2 ml de solution enzymatique préparée à l’étape 2.2.5. Placez le tube dans le dissociateur tissulaire et exécutez le programme : 37C_ABDK_01 (prend ~30 min).</li>
		<li>Placez les échantillons dans un bain-marie à 37 °C pendant ~20 min et triturez le mélange toutes les 5 min à l’aide d’une pipette de 1 mL sans faire de bulles. REMARQUE : Ce processus doit être poursuivi jusqu’à ce que le tissu soit complètement dissocié et apparaisse complètement homogène pour assurer une dissociation efficace. Toutes les étapes de centrifugation suivantes sont effectuées à 4 °C, sauf indication contraire.</li>
		<li>Retirer délicatement la suspension à cellules troubles dans un nouveau tube de 15 mL et centrifuger à 300 × g pendant 5 min.</li>
		<li>Pendant cette période de 5 minutes, préparer le mélange de lavage suivant (5 ml) par échantillon ; ajouter 500 μL de solution d’inhibiteur de l’albumine-ovomucoïde reconstituée fournie dans la trousse de papaïne à 4,5 mL de LCRa. Ajouter le reste de la solution dans le flacon 3 de l’étape 2.2.5 au mélange de lavage.</li>
		<li>Jeter le surnageant de l’étape 2.2.8 et remettre immédiatement en suspension la pastille de cellule dans la solution de mélange de lavage.</li>
		<li>Passez l’échantillon à travers un filtre de 70 μm dans un nouveau tube de microcentrifugation de 5 mL. Centrifuger les échantillons à 300 × g pendant 5 min.</li>
		<li>Procédez à l’étape de centrifugation à gradient Percoll expliquée précédemment aux étapes 1.7-1.9.</li>
		<li>Remettez soigneusement les cellules en suspension dans le tampon de coloration MACS en pipetant lentement de haut en bas. Incuber les échantillons pendant 15 min à 4 °C.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de tampon MACS à chaque échantillon et centrifuger à 300 × g pendant 8 min.</li>
		<li>Remettez les cellules en suspension dans 500 μL de tampon MACS.</li>
		<li>Placez les colonnes de sélection positive dans le séparateur magnétique. Équilibrez les colonnes en les rinçant avec 3 mL de MACS Buffer.</li>
		<li>Mélangez délicatement et appliquez 500 μL de suspension cellulaire sur la colonne. Lavez les colonnes 3 fois avec 3 mL de tampon MACS.</li>
		<li>Retirez les colonnes du séparateur magnétique et placez-les sur des tubes coniques de 15 ml. Ajoutez 5 ml de tampon MACS sur la colonne et rincez immédiatement les cellules à l’aide d’un repulpeur. Centrifuger les échantillons à 300 × g pendant 10 min.</li>
		<li>Pendant cette période, préparer 20 mL de FBS à 40 % dans du DPBS. Préchauffer 1 mL de DMEM par échantillon jusqu’à 37 °C dans un bain-marie.</li>
		<li>Dissoudre la pastille de cellule finale dans 1 mL de DMEM préchauffé. Ensemencez environ ~150 000 à 200 000 cellules dans 500 μL de DMEM préchauffé par puits dans une plaque à 24 puits. Comme témoin, ensemencez un nombre similaire de cellules dans 1 à 2 puits supplémentaires. Vérifiez la confluence des cellules dans tous les puits à l’aide d’un microscope optique. REMARQUE : Si la région cérébrale cible est l’hippocampe ou des régions cérébrales de taille comparable, 5 souris peuvent être regroupées par échantillon (n) pour isoler ~150 000 microglies. Pour l’ensemble du cerveau, 1 souris par n suffira pour obtenir un nombre similaire de cellules en utilisant les deux protocoles d’isolement. Alternativement, ~40 000 cellules peuvent être plaquées dans des plaques de 96 puits dans un volume final de 100 μL pour commencer l’essai d’engloutissage. Cela réduit le nombre de cellules analysées mais réduit également le nombre de souris utilisées par n. La privation de protéines due à l’absence de FCS dans le DMEM déclenchera la phagocytose.</li>
		<li>Incuber la plaque pendant 1 à 2 h dans l’incubateur (37 °C et 5% CO2). REMARQUE : Cette étape vise à ce que les cellules se remettent des effets sujets au stress de la procédure d’isolement avant le début de l’essai d’engloutissement fonctionnel.</li>
		<li>Prélevez très lentement 250 μL de milieu dans chaque puits, ajoutez 250 μL de DMEM frais préchauffé dans chaque puits et ajoutez 3 μg de synaptosomes marqués en rouge pHRodo sur le dessus. Vérifiez la confluence cellulaire dans tous les puits à l’aide d’un microscope optique.<ol><li>Pour les puits de contrôle négatifs, ajoutez la même quantité de synaptosomes non marqués au puits supplémentaire ensemencé de cellules.</li>
			<li>Pour les puits d’essai, assurez-vous que le puits 1 ne contient que des cellules ; puits 2 contient des cellules + synaptosomes non marqués ; well-3 contient des cellules + 3 μg de pHrodo Red ; bien 4 contient du DMEM + 3 μg de pHrodo Red.</li>
		</ol></li>
		<li>Incuber les cellules avec des synaptosomes pendant 2 h dans l’incubateur (37 °C et 5% CO2).</li>
		<li>Sortez le milieu et lavez les puits avec du DPBS froid. Ajouter 200 μL de solution de trypsine/EDTA par puits pour détacher les cellules pendant 35 s.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de FBS à 40 % de DPBS par puits et transférer les cellules dans un tube de polypropylène de 5 mL à travers la passoire. Gardez la plaque et le tube sur de la glace pendant ce processus pour faciliter le détachement des cellules.</li>
		<li>Lavez chaque puits 2 fois avec 500 μL de DPBS glacé. Centrifuger les échantillons prélevés à 500 × g pendant 5 min.</li>
		<li>Remettre les cellules en suspension dans la solution de coloration contenant 1/200 CD16/CD32 dans 100 μL de tampon FACS et incuber pendant 10 min sur de la glace.</li>
		<li>Après l’incubation, ajouter CD11b et CD45 à la solution de coloration avec une concentration finale de 1/100 de chacun. Incuber les échantillons pendant 20 min à 4 °C dans l’obscurité.</li>
		<li>Lavez les échantillons avec 1 mL de tampon FACS et centrifugez-les à 300 × g pendant 10 min.</li>
		<li>Remettre la pastille en suspension dans 250 μL de tampon FACS et enregistrer au moins 100 000 événements au total à l’aide de la cytométrie en flux. Analysez l’intensité de fluorescence du rouge pHrodo à partir de la microglie CD11b++/CD45+ .</li>
		<li>Stratégie de contrôle (figure 2C)<ol><li>Ajustez la porte principale : zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) [axe x] et zone de diffusion latérale (SSC-A) [axe x] pour inclure la population de microglie dans la zone fermée et exclure les débris cellulaires.</li>
			<li>Ajustez la zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) [axe x] et la hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H) [axe y] pour exclure les doublets. Les maillots apparaissent en diagonale sur ce graphique à points.</li>
			<li>Ajustez CD11b-PECy7 [axe y] et CD45-APC [axe x] et limitez la population avec un niveau de surface élevé CD11b et un niveau moyen de CD45 sous forme de microglie.</li>
			<li>Calculez l’intensité médiane de fluorescence de pHrodo-PE à partir de cette population. Utilisez les mêmes cellules incubées avec des synaptosomes non marqués comme contrôle négatif.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Tests basés sur la cytométrie en flux pour l’engloutissement microglial de matériaux synaptiques

<ol>
	<li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+physiology+and+Disease.">Microglia in physiology and Disease.</a> Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).</li><li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+contribute+to+circuit+defects+in+Mecp2+null+mice+independent+of+microglia-specific+loss+of+Mecp2+expression.">Microglia contribute to circuit defects in Mecp2 null mice independent of microglia-specific loss of Mecp2 expression.</a> eLife. 5, e15224 (2016).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner.">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li><li>Filipello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microglial+innate+immune+receptor+TREM2+is+required+for+synapse+elimination+and+normal+brain+connectivity.">The microglial innate immune receptor TREM2 is required for synapse elimination and normal brain connectivity.</a> Immunity. 48 (5), 979-991 (2018).</li><li>Salter, M. 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D. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+integrity+and+complement+control+synaptic+material+clearance+by+microglia+after+CNS+injury.">Neuronal integrity and complement control synaptic material clearance by microglia after CNS injury.</a> JEM. 215 (7), 1789-1801 (2018).</li><li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations.">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 7944 (2020).</li><li>Jaszczyk, A., Stankiewicz, A. M., Juszczak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+mouse+hippocampus+with+its+dorsal,+intermediate+and+ventral+subdivisions+combined+with+molecular+validation.">Dissection of mouse hippocampus with its dorsal, intermediate and ventral subdivisions combined with molecular validation.</a> Brain Sci. 12 (6), 799 (2022).</li><li>Fixable viability dyes for flow cytometry. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html</a> (2024)</li><li>SynPER synaptic protein extraction reagent. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P</a> (2024)</li><li>Wu, A., Yu, B., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+olfactory+bulb+circuits.">Plasticity in olfactory bulb circuits.</a> Curr Opin Neurol. 64, 17-23 (2020).</li><li>pHrodo indicators for pH determination. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html</a> (2024)</li><li>Rangaraju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phagocytic+properties+of+CD45low+microglia+and+CD45high+brain+mononuclear+phagocytes-activation+and+age-related+effects.">Differential phagocytic properties of CD45low microglia and CD45high brain mononuclear phagocytes-activation and age-related effects.</a> Front Immunol. 9, 405 (2018).</li><li>Weinhard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+remodel+synapses+by+presynaptic+trogocytosis+and+spine+head+filopodia+induction.">Microglia remodel synapses by presynaptic trogocytosis and spine head filopodia induction.</a> Nat Commun. 9 (1), 1228 (2018).</li><li>Morizawa, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+through+glial+synapse+engulfment+upon+motor+learning.">Synaptic pruning through glial synapse engulfment upon motor learning.</a> Nat Neurosci. 25 (11), 1458-1469 (2022).</li><li>Morini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+studying+microglial-mediated+synapse+elimination+and+refinement.">Strategies and tools for studying microglial-mediated synapse elimination and refinement.</a> Front. Immunol. 12, 640937 (2021).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry. Part A: J. Int Soc Anal Cytol. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>. Strategies for intracellular flow cytometry success Available from: <a target="_blank" href="https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/">https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/</a> (2022)</li><li>. Isotype control antibodies, Key points Available from: <a target="_blank" href="https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used">https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used</a> (2024)</li><li>Flow cytometry intracellular staining controls. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html</a> (2024)</li><li>Dissing-Olesen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEAST:+A+flow+cytometry-based+toolkit+for+interrogating+microglial+engulfment+of+synaptic+and+myelin+proteins.">FEAST: A flow cytometry-based toolkit for interrogating microglial engulfment of synaptic and myelin proteins.</a> Nat Commun. 14, 6015 (2023).</li><li>Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+general+and+discriminating+markers+of+differential+microglia+phenotypes.">Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes.</a> Front Cell Neurosci. 14, 198 (2020).</li><li>van Wageningen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+microglial+TMEM119+and+P2RY12+immunoreactivity+in+multiple+sclerosis+white+and+grey+matter+lesions+is+dependent+on+their+inflammatory+environment.">Regulation of microglial TMEM119 and P2RY12 immunoreactivity in multiple sclerosis white and grey matter lesions is dependent on their inflammatory environment.</a> Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 206 (2019).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Le raffinement synaptique par l’interaction microglie-synapse est un domaine d’étude intrigant dans le domaine de la neuroimmunologie, offrant des perspectives prometteuses sur le rôle de la microglie dans les troubles neurodégénératifs et neurodéveloppementaux. En 2011 ; Paolicelli et al. ont fourni des preuves de la présence de matériel synaptique dans la microglie, mettant en lumière leur implication dans le processus d’engloutissement synaptique4. Une autre étude intrigante a utilisé l’imagerie en accéléré et un modèle de culture de tranches de cerveau organotypique ex vivo et a rapporté que les microglies s’engagent dans un processus phagocytaire connu sous le nom de trogocytose, où elles engloutissent les structures présynaptiques plutôt que la structure synaptique entière23. Une publication très récente utilisant un nouveau modèle de souris transgénique qui permet de mesurer la phagocytose dans les tissus intacts a montré l’élagage par la glie de Bergmann in vivo sur apprentissage moteur24. Ainsi, il existe suffisamment de preuves indiquant l’implication des cellules gliales dans l’engloutissement synaptique, y compris la microglie. Cependant, la mesure dans laquelle cette fonction microgliale a un impact sur le processus dynamique et sélectif de l’élagage synaptique nécessite des preuves supplémentaires.
Néanmoins, la quantification de l’engloutissement microglial des synapses sert d’indicateur précieux et fournit un aperçu partiel de la dynamique complexe des interactions microglie-synapse, en particulier le raffinement synaptique. Une revue complète a résumé les protocoles actuels utilisés pour étudier l’engloutissement microglial des synapses25. Nous tenons à souligner que nos protocoles sont optimisés sur la base des protocoles existants qui sont déjà utilisés. Les méthodes présentées dans cette étude fournissent une quantification rapide et à haut débit de l’engloutissement microglial des synapses dans diverses régions cérébrales disséquées. Selon la région du cerveau, une analyse d’au moins 10 000 cellules microgliales en deux jours maximum est possible pour les deux méthodologies, ce qui les rend précieuses pour tester plusieurs modèles de souris en parallèle.
Nous reconnaissons que la quantification de la microglie vGLUT1+ comprend à la fois l’absorption in vivo et à court terme ex vivo jusqu’à l’étape de fixation. Par conséquent, nous suggérons que notre test présente un moyen rapide et fiable de quantifier le matériel synaptique à l’intérieur de la microglie comme première étape avant la validation in vivo à l’aide d’approches telles que l’IHC.
Un autre inconvénient de l’analyse par cytométrie en flux est la disponibilité limitée d’anticorps pour les marqueurs synaptiques, en particulier pour les synapses inhibitrices. Il est difficile de trouver des anticorps directement conjugués disponibles dans le commerce qui montrent un signal brillant pour ces marqueurs. Étant donné le temps d’optimisation considérable nécessaire pour tester différents anticorps ciblant les marqueurs synaptiques, il est important de partager les procédures bien optimisées avec la communauté scientifique pour la coloration intracellulaire avec différents anticorps, comme nous le faisons ici avec cette étude.
En ce qui concerne l’analyse des données dans cette étude, nous avons utilisé des contrôles isotypes comme contrôles négatifs techniques pour tenir compte des liaisons non spécifiques de l’anticorps vGLUT1, car ils fournissent une estimation de la liaison non spécifique d’un anticorps dans un échantillon tout en optimisant les tests basés sur la cytométrie en flux26. Cependant, les contrôles d’isotype ont été principalement optimisés pour détecter le signal de fond non spécifique des procédures de coloration de surface et ne sont pas optimaux pour les contrôles de coloration intracellulaire27,28. Par conséquent, il ne faut pas compter sur eux pour faire la distinction entre les populations négatives et positives lors de la réalisation d’une coloration intracellulaire, qui implique des étapes de fixation et de perméabilisation qui peuvent avoir un impact sur la détection de l’antigène, l’autofluorescence et la luminosité du fluorophore29. De telles procédures de coloration intracellulaire nécessitent l’utilisation de contrôles biologiques internes appropriés pour définir la population cellulaire positive colorée pour un marqueur intracellulaire29. Ainsi, considérant que nous utilisons un protocole de coloration intracellulaire, nous avons utilisé un contrôle biologique négatif interne (macrophages de rate) et défini la limite entre les populations positives et négatives en fonction des macrophages de rate isolés chez les mêmes souris. Nous avons distingué la population positive au-dessus de la porte, à laquelle il n’y a pas d’événements positifs vGLUT1, des macrophages de la rate qui servent de contrôle biologique négatif (Figure 1).
Les deux méthodes présentées dans cette étude offrent un grand potentiel pour l’analyse initiale de l’engloutissement microglial des synapses de manière rapide et à haut débit, en analysant plus de 10 000 cellules de petites régions cérébrales, ce qui n’est pas réalisable avec les techniques de microscopie standard. Par conséquent, ces méthodes offrent un avantage significatif par rapport aux méthodes gourmandes en main-d’œuvre et en temps, et fournissent en outre une analyse plus complète de l’engloutissement synaptique en permettant une analyse d’un plus grand nombre de microglies. De plus, la méthode in vitro présentée dans cette étude est particulièrement utile pour tester l’impact de différents traitements sur l’engloutissement microglial des synapses. Il permet de quantifier directement l’effet du traitement sur la microglie sans les facteurs de confusion associés à d’autres types de cellules. De plus, il s’agit d’une approche indirecte pour prouver un effet potentiel du microenvironnement ou d’autres types de cellules sur le processus d’engloutissement synaptique. Par conséquent, nous concluons que ces méthodes, en particulier lorsqu’elles sont utilisées en parallèle, offrent des alternatives intuitives et avantageuses pour l’analyse de l’engloutissement microglial des matériaux synaptiques.
Cependant, l’analyse de microglies fraîchement isolées par des essais phagocytaires basés sur FACS ex vivo peut présenter quelques inconvénients. Tout d’abord, il est essentiel d’utiliser des protocoles bien optimisés qui génèrent des microglies fraîchement isolées à partir du cerveau adulte tout en évitant l’activation ex vivo et la réponse au stress de la microglie. Dissing-Olesen et al. ont incorporé l’utilisation d’inhibiteurs transcriptionnels et translationnels pour surmonter ce problème en utilisant une procédure de dissociation tissulaire à 37 °C30. Mattei et al., d’autre part, ont présenté un protocole de dissociation tissulaire mécanique et froide pour éviter d’induire l’expression ex vivo des gènes associés au stress16 et nous avons adapté ce protocole dans la première section pour éviter l’activation ex vivo de la réponse microgliale associée au stress avant la coloration intracellulaire vGLUT1. Nous avons utilisé un protocole de dissociation enzymatique des tissus dans la deuxième section avant l’essai d’engloutissement des synaptosomes in vitro , compte tenu du rendement plus élevé de la microglie après la dissociation des tissus à base de papaïne (données non présentées). La microglie reste inévitablement à 37 °C dans des conditions de culture lorsqu’elle est incubée avec des synaptosomes, et l’incubation à 37 °C peut en effet induire des changements dans la microglie comme inconvénients communs à tous les essais in vitro et procédures de culture cellulaire. Par conséquent, nous suggérons l’utilisation des deux protocoles présentés en parallèle pour parvenir à une conclusion plus large en termes d’engloutissement microglial des synapses.
De plus, il est important de définir soigneusement la stratégie de déclenchement pour sélectionner la microglie CD11b++/CD45+ en tenant compte de la présence d’autres cellules immunitaires dans le parenchyme cérébral qui expriment également ces marqueurs31. Plus important encore, lors du choix de marqueurs pour cibler spécifiquement les microglies (par exemple, TMEM119, P2RY12), il est important de tenir compte du fait qu’elles peuvent subir des changements dans leurs niveaux d’expression au cours d’états pathologiques et inflammatoires32, et ces changements doivent être pris en compte avant d’établir le panel FACS pour quantifier l’engloutissement microglial des synapses. Enfin, il est essentiel de souligner qu’aucune des méthodes discutées précédemment, y compris les approches in vivo basées sur l’IHC et la microscopie, ne peut à elle seule capturer l’élagage actif et sélectif des synapses par la microglie. Ces méthodes ne sont pas en mesure de distinguer l’élagage actif par la microglie de l’élagage passif des débris synaptiques dans le parenchyme cérébral. Par conséquent, lors de l’évaluation et de la discussion des données, il est impératif de faire une distinction claire entre ces concepts distincts.

Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC)1. Ils scannent constamment leur microenvironnement et assurent une surveillance 1,2. De plus, ils interagissent fréquemment avec les synapses et médient un réglage fin de l’activité synaptique3. Ainsi, ils sont apparus comme un acteur clé dans le processus de raffinement synaptique.
Le rôle de la microglie dans le raffinement synaptique par l’engloutissement des synapses a été démontré par divers groupes de recherche 3,4,5,6,7. Les perturbations de ce processus peuvent contribuer à la pathologie de troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs tels que la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer8. Un raffinement synaptique aberrant par la microglie a déjà été détecté dans divers modèles murins de troubles neurologiques 5,9,10. Par conséquent, l’identification des mécanismes distincts sous-jacents à l’engloutissement microglial des synapses est primordiale pour comprendre la physiopathologie des troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs8.
Le ciblage de l’engloutissement microglial des synapses présente un grand potentiel pour intervenir dans la progression de la maladie et pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents des troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs. Pour faciliter de telles enquêtes, il est nécessaire de recourir à des approches rapides et à haut débit. Les approches méthodologiques actuelles englobent les essais in vivo, ex vivo et in vitro qui permettent de détecter le matériel synaptique dans la microglie. En général, la détection de l’engloutissement microglial des synapses repose fortement sur l’immunohistochimie (IHC) et les approches basées sur la microscopie 5,6,11, qui demandent beaucoup de travail et montrent des limites dans l’analyse d’un grand nombre de microglies.
Compte tenu de ces limites techniques, il est impératif d’explorer d’autres méthodologies. Pour surmonter cela, nous avons optimisé une approche basée sur la cytométrie en flux, qui permet une analyse efficace, impartiale et à haut débit de l’engloutissement microglial des synapses. Nous avons choisi l’hippocampe comme région d’intérêt principale en raison de son haut degré de remodelage synaptique et de plasticité12, mais le protocole peut être adapté à diverses régions du cerveau. Bien que la cytométrie en flux ait déjà été utilisée dans des études précédentes pour détecter l’engloutissement microglial des synapses13, 14, 15, nous fournissons ici une méthodologie étape par étape utilisant un anticorps vGLUT1 conjugué aux fluorophores actuellement disponible dans le commerce. De plus, nous proposons une approche in vitro complémentaire pour le criblage à haut débit de l’engloutissement microglial du matériel synaptique en utilisant des synaptosomes bruts.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Dounce Homogenizer</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>Cat# 40401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat# 0030119452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11b</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 25-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 559864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6C</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 553104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 551460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Cat# 23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16/CD32 Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#14-0161-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixable viability dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# L34969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# A1247501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS-columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>Cat# 17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11339283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodoRed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# P36600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>Cat# 5892970001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat# 11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop E-GP Sterile Filtration System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# SEGPT0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynPer Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 87793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGLUT1 Antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-120-764</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of microglial engulfment of synaptic material using flow cytometry

La microglie joue un rôle central dans le raffinement synaptique dans le cerveau. L’analyse de l’engloutissement microglial des synapses est essentielle pour comprendre ce processus ; cependant, les méthodes actuellement disponibles pour identifier l’engloutissement microglial des synapses, telles que l’immunohistochimie (IHC) et l’imagerie, sont laborieuses et chronophages. Pour relever ce défi, nous présentons ici des tests in vitro et in vivo* qui permettent une quantification rapide et à haut débit de l’engloutissement microglial des synapses à l’aide de la cytométrie en flux.
Dans l’approche in vivo* , nous avons effectué une coloration intracellulaire de vGLUT1 après isolement de cellules fraîches dans des cerveaux de souris adultes afin de quantifier l’engloutissement des synapses vGLUT1+ par la microglie. Dans l’essai in vitro sur l’engloutissement des synaptosomes, nous avons utilisé des cellules fraîchement isolées du cerveau de souris adultes pour quantifier l’engloutissement des synaptosomes marqués pHrodo Red par la microglie. Ensemble, ces protocoles offrent une approche rapide pour quantifier l’engloutissement microglial des synapses et représentent des alternatives prometteuses aux méthodes basées sur l’analyse d’images. En rationalisant l’analyse, ces tests peuvent contribuer à une meilleure compréhension du rôle de la microglie dans le raffinement synaptique dans différents modèles de maladies.

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS)1. They constantly scan their microenvironment and provide surveillance1,2. Moreover, they frequently interact with synapses and mediate a fine-tuning of the synaptic activity3. Thus, they have emerged as a key player in the process of synaptic refinement.
The role of microglia in synaptic refinement through the engulfment of synapses has been shown by various research groups3,4,5,6,7. Disruptions in this process can contribute to the pathology of neurodevelopmental and neurodegenerative disorders such as schizophrenia and Alzheimer&#39;s disease8. Aberrant synaptic refinement by microglia has already been detected in various murine models of neurological disorders5,9,10. Therefore, identification of distinct mechanisms underlying microglial engulfment of synapses is paramount to understanding the pathophysiology of neurodevelopmental and neurodegenerative disorders8.
Targeting microglial engulfment of synapses holds great potential for both intervening in disease progression and gaining insights into the underlying mechanisms of neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. To facilitate such investigations, there is a need for fast and high-throughput approaches. Current methodological approaches encompass in vivo, ex vivo, and in vitro assays that enable the detection of synaptic material within microglia. Generally, the detection of microglial engulfment of synapses relies heavily on immunohistochemistry (IHC) and microscopy-based approaches5,6,11, which are labor-intensive and show limitations in analyzing a large number of microglia.
Given these technical limitations, the exploration of alternative methodologies is imperative. To overcome this, we have optimized a flow cytometry-based approach, which enables an efficient, unbiased, and high-throughput analysis of microglial engulfment of synapses. We chose the hippocampus as the main region of interest due to its high degree of synaptic remodeling and plasticity12, but the protocol can be adapted to various brain regions. While flow cytometry has already been used in previous studies to detect microglial engulfment of synapses13,14,15, we herein provide a step-by-step methodology employing a currently commercially available, fluorophore-conjugated vGLUT1 antibody. We, moreover, provide a complementary&#160;in vitro approach for high-throughput screening of microglial engulfment of synaptic material by using crude synaptosomes.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la compréhension grâce aux innovations technologiques en psychoneuroimmunologie

Quantification de l’engloutissement microglial du matériel synaptique à l’aide de la cytométrie en flux

Dans ce projet, nous avons optimisé et présenté deux protocoles pour mesurer in vivo* et in vitro l’engloutissement des synapses par la microglie. Dans le premier protocole, nous nous sommes concentrés sur l’engloutissement in vivo* de synapses vGLUT1-positives. Comme point de départ, nous avons utilisé un protocole14 précédemment publié. Cependant, les anticorps FACS utilisés dans ce protocole sont abandonnés et nous avons ajouté de nombreuses étapes d’optimisation ainsi qu’une nouvelle méthode d’isolement de la microglie16. C’est pourquoi le protocole présenté ici mérite d’être partagé avec la communauté scientifique en tant que mise à jour complète des protocoles déjà publiés.
Pour quantifier l’engloutissement microglial des synapses, nous avons utilisé des souris mâles C57BL/6N âgées de 11 à 14 semaines. L’hippocampe a été choisi comme la principale région d’intérêt en raison de son haut degré de remodelage synaptique et de plasticité12. Nous avons analysé la microglie %vGLUT1-positive ainsi que l’intensité de fluorescence (MFI) vGLUT1-PE spécifique à la microglie dans l’hippocampe de souris C57BL/6N. Des macrophages de rate dérivés des mêmes animaux ont été utilisés comme contrôle biologique négatif par expérience. Nous avons testé l’anticorps vGLUT1 en démontrant un signal de fluorescence vGLUT1-PE plus élevé provenant de la microglie de l’hippocampe par rapport au contrôle de l’isotype et aux macrophages de la rate (Figure 1B-E)
De plus, nous avons comparé l’engloutissement microglial des synapses dans le cervelet ainsi que dans le bulbe olfactif (comme une autre référence pour une plasticité synaptique élevée)20. Nous avons trouvé un signal de fluorescence vGLUT1 plus élevé dans la microglie du bulbe olfactif et un signal plus faible dans le cervelet par rapport à l’hippocampe (Figure 1F). L’intensité du signal la plus faible a été détectée dans les macrophages de la rate, servant de contrôle négatif interne (Figure 1E). De plus, nous avons utilisé des souris Vglut-IRES-Cre/ChR2-YFP pour tester l’immunoréactivité de notre anticorps vGLUT1. YFP est exprimé par les neurones glutamatergiques de ces souris, ce qui indique que la population YFP-positive devrait également inclure une fraction vGLUT1-positive. En utilisant ce protocole de coloration, nous avons détecté 98,7 % de la population YFP-positive comme vGLUT1-positive, validant l’efficacité de notre anticorps (Figure supplémentaire S3).
Dans l’ensemble, ces résultats valident l’efficacité de l’anticorps vGLUT1 et le protocole de coloration présenté. Nous démontrons que ce protocole et l’anticorps peuvent être utilisés en toute confiance pour quantifier l’incorporation in vivo* des synapses de manière rapide et à haut débit par rapport à d’autres approches expérimentales.
Passant à la méthode in vitro, nous avons isolé des microglies adultes et les avons incubées avec des synaptosomes pHrodo Red Labellisés fraîchement isolés provenant des mêmes animaux pour quantifier leur engloutissement in vitro (Figure 2A). Nous avons marqué les synaptosomes avec du pHrodo Red, qui augmente naturellement le signal de fluorescence dans le pH acide environnant2 1. Nous avons fraîchement isolé des synaptosomes et les avons exposés à différentes valeurs de pH (pH = 4 et pH = 11). Après avoir confirmé l’augmentation du signal de fluorescence à faible pH comme expérience de preuve de principe (Figure 2B), nous avons incubé ces synaptosomes avec des microglies fraîchement isolées pendant 1,5 à 2 h. Comme contrôle, nous avons incubé des microglies avec des synaptosomes non marqués. Ensuite, nous avons analysé le signal de fluorescence pHrodo Red-PE de la microglie CD11b++/CD45+ et observé une fluorescence PE positive, comparable à celle obtenue à partir des synaptosomes à pH = 4 (Figure 2C). Ainsi, cette méthode permet une analyse rapide et à haut débit de l’engloutissement in vitro des synaptosomes et peut être étendue aux plaques amyloïdes ou à l’engloutissement d’autres cibles potentielles suite aux étapes d’optimisation nécessaires. En effet, Rangaraju et al. ont quantifié l’engloutissement de la bêta-amyloïde par la microglie en utilisant une approche similaire basée sur la cytométrie en flux22. En conclusion, ces deux méthodes fournissent une quantification robuste, efficace et à haut débit de l’engloutissement microglial des synapses à la fois in vivo* et in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig01v4.jpg"> Figure 1 : Analyse de l’engloutissement microglial des synapses vGLUT1+ in vivo*. (A) Illustration graphique du flux de travail expérimental décrivant les étapes de la coloration intracellulaire de vGLUT1. (B) Stratégie de contrôle pour définir une population de cellules viables uniques/CD11b++/CD45+/ de l’hippocampe. Cette population a été utilisée pour analyser vGLUT1-MFI ainsi que pour quantifier le pourcentage de microglie vGLUT1+ dans l’hippocampe. La porte représentée par le rectangle rouge indique la fraction de cellules vGLUT1+ dans l’échantillon total. (C) L’histogramme indique l’intensité de fluorescence de vGLUT1-PE. (D) La porte représentée par le rectangle rouge indique qu’il n’y a pas de fraction cellulaire positive montrant une immunoréactivité de l’isotype-PE. L’histogramme indique l’intensité de fluorescence de l’isotype-PE. (E) La porte représentée par le rectangle rouge indique qu’il n’y a pas de fraction cellulaire positive montrant une immunoréactivité vGLUT1-PE dans les macrophages de la rate. L’histogramme indique l’intensité de la fluorescence vGLUT1-PE. La porte indiquée sur l’histogramme commence au niveau où se termine le vGLUT1-MFI de la rate (~104) et est utilisée pour analyser la fraction positive de vGLUT1 dans les échantillons de cerveau. (F) L’histogramme superposé montre la comparaison de l’intensité de fluorescence PE des macrophages de la rate (gris) et de la microglie de l’hippocampe (rouge), du cervelet (violet) et du bulbe olfactif (bleu clair). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig02.jpg"> Figure 2 : Analyse de l’engloutissement microglial des synaptosomes synaptiques in vitro. (A) Illustration graphique du flux de travail expérimental décrivant les étapes de l’essai in vitro d’engloutissement des synaptosomes. (B) Les synaptosomes incubés à deux valeurs de pH différentes montrent un signal de fluorescence faible pHrodo Red-PE à pH = 11 et une fluorescence pHrodoRed-PE élevée à pH = 4. (C) Une population de cellules uniques/CD11b++/CD45+ a été utilisée pour analyser l’intensité de fluorescence de pHrodo Red-PE. Des microglies incubées avec des synaptosomes non colorés ont été utilisées comme contrôle négatif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Liste des tampons et réactifs utilisés dans ce protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_table%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Figure supplémentaire S1 : Image représentative d’une microglie adulte fraîchement isolée. Image acquise à l’aide d’un microscope optique avec objectif 20x suivant le protocole de dissociation tissulaire basé sur la papaïne et l’isolement de la microglie CD11b+ basé sur MACS. Barre d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-1.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S2 : Graphiques FACS représentatifs démontrant la stratégie de déclenchement pour définir les macrophages de la rate. La rate a été utilisée comme contrôle négatif dans les expériences par cycle expérimental lors de l’essai de l’engloutissement microglial des synapses dans l’hippocampe. Les graphiques FACS donnés ci-dessus définissent les macrophages de la rate comme CD11b++/CD45++/population viable. Cette population a été utilisée pour établir un seuil permettant de quantifier la microglie vGLUT1+ dans les échantillons de cerveau qui résident au-dessus de cette porte seuil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-2.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S3 : Graphiques FACS représentatifs démontrant la stratégie de contrôle pour tester l’efficacité de l’anticorps vGLUT1. (A) Illustration graphique du flux de travail expérimental décrivant les étapes de la coloration vGLUT1. Les neurones glutamatergiques YFP+ ont été utilisés pour tester l’immunoréactivité de l’anticorps vGLUT1. (B) Stratégie de contrôle pour définir la population YFP+ à partir de l’hippocampe de souris Vglut-IRES-Cre//ChR2-YFP qui ont été utilisées comme contrôle positif pour tester l’efficacité de l’anticorps vGLUT1 FACS. La fraction YFP+ a été contrôlée pour spécifier les synapses glutamatergiques. Dans cette population, l’immunoréactivité de l’anticorps vGLUT1 a été analysée pour tester l’immunoréactivité de l’anticorps. Par rapport au contrôle de l’isotype (C) ; 97,9 % de la fraction cellulaire YFP-positive est détectée comme (D) vGLUT1-positive. (E) L’histogramme superposé indique la comparaison de la fluorescence PE entre l’isotype et l’anticorps vGLUT1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-3.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous présentons ici deux protocoles pour quantifier l’engloutissement microglial des synapses vGLUT1-positives et des synaptosomes bruts marqués en rouge pHRodo à l’aide de la cytométrie en flux.

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

Nos recherches portent sur la psychoneuroimmunologie et nous étudions la diaphonie du système immunitaire avec le cerveau et l’esprit. Je m’intéresse particulièrement au déchiffrage de sous-groupes de patients en fonction de leur statut immunitaire afin de trouver des traitements adaptés à leurs besoins. Les développements récents dans notre domaine comprennent, par exemple, le développement de ligands TEP, mais aussi des technologies avancées telles que le séquençage de l’ARN, le séquençage de l’ARN sur cellule unique et le séquençage spatial de l’ARN pour déchiffrer les thérapies immunitaires.Notre protocole relève le défi de la quantification de l’engloutissement microglial du matériel synaptique, ce qui est crucial pour comprendre le rôle dans le fonctionnement du cerveau ainsi que dans la pathologie de la maladie. Notre protocole offre une quantification rapide et fiable du matériel synaptique englouti par la microglie, et fournit donc des informations sur l’activité fonctionnelle de la microglie. Notre protocole inspirera d’autres groupes de recherche à inclure des tests plus fonctionnels dans leurs recherches, tels que les motosynaptosomes engloutis, ce qui conduira à une compréhension meilleure et plus complète du rôle de la microglie dans les interactions neuro-immunes.

quantification-microglial-engulfment-synaptic-material-using-flow

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

594 vues.  Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association. Nos recherches portent sur la psychoneuroimmunologie et nous étudions la diaphonie du système immunitaire avec le cerveau et l’esprit. Je m’intéresse particulièrement au déchiffrage de sous-groupes de patients en fonction de leur statut immunitaire afin de trouver des traitements adaptés à leurs besoins. Les développements récents dans notre domaine comprennent, par exemple, le développement de ligands TEP, mais aussi des technologies avancées telles que le séquençage de l’...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la compréhension grâce aux innovations technologiques en psychoneuroimmunologie

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.