미세아교세포 분리에 대한 기술 지원을 제공한 Regina Piske와 보충 그림 S1에서 현미경 이미지 획득에 도움을 준 Caio Andreta Figueiredo 박사에게 감사드립니다. MDC의 FACS 시설의 기술 지원에 감사드립니다. 본 논문은 2024년 Brain, Behavior and Immunity Journal에 제출된 대표 수치를 일부 제시한 것이다. 그림 1A, 그림 2A 및 보충 그림 S3A 는 BioRender.com 를 사용하여 생성되었습니다.

실험 절차의 일반적인 보기는 그림 1A에 그래픽으로 설명되어 있습니다. 살아 있는 동물을 다루는 모든 실험은 독일 동물보호법에 따라 엄격하게 수행되었으며, 베를린 보건사회복지국(Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Germany)의 승인을 받았다. 생쥐는 Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC)의 동물 핵심 시설에서 12:12 h 밝음/어두운 주기로 표준 실험실 조건 하에서 환기 케이지에 집단 수용되었습니다. 음식과 물은 임시로 제공되었습니다.완충액 및 시약의 구성에 대해서는 표 1 을 참조하고, 이 프로토콜에 사용된 모든 시약, 기기 및 물질과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. vGLUT1 특이적 분석의 경우, 유세포 분석은 조직 균질화 및 세포 분리가 필요하며 미세아교세포는 분리 절차 후 약 95%의 생존율을 나타낸다는 것을 인정하기 위해 원고 전반에 걸쳐 in vivo*라는 용어를 사용했습니다(그림 1B 및 보충 그림 S1). 그러므로, 그들은 고정될 때까지 짧은 기간 동안 시냅스 물질을 생체 외에서 삼키는 능력을 유지합니다. 따라서, vGLUT1+ 미세아교세포의 정량화는 in vivo 및 short-term ex vivo engulfment를 모두 포함하며, 이는 고정 단계까지 이루어진다.
1. 미세아교세포에 의한 glutamatergic synapses의 in vivo* engulfment 검출을 위한 세포내 vGLUT1 염색
참고: 다음 세포 분리 절차는16에서 조정되었습니다. 세포 분리의 모든 단계는 얼음 위에서 수행해야 합니다.
<ol><li>펜토바르비탈의 복강내 주사를 사용하여 마우스를 마취합니다. ~2분 동안 10mL의 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)를 심내로 관류합니다. 참고: 샘플(n)당 하나의 마우스가 사용됩니다.</li>
	<li>두개골에서 뇌를 꺼내 1mL의 신경 세포 배지에 보존합니다. 참고: Hibernate-A 배지와 같은 신경 세포 배지는 조직 해리 과정 후 세포의 높은 생존력을 보장하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>얼음처럼 차가운 신경 세포 배지 1mL로 채워진 페트리 접시에 뇌를 옮기고 앞서 설명한 대로 해마를 해부합니다17.</li>
	<li>해마를 1mL의 신경 세포 배지로 채워진 Dounce 균질화기로 옮기고 약 ~ 25 번의 부드러운 스트로크로 느슨한 유봉을 사용하여 조직을 해리합니다.</li>
	<li>5mL 폴리프로필렌 튜브에 70μm 스트레이너를 놓고 500μL의 신경 세포 배지를 추가합니다. 조직 균질액을 여과기를 통해 5mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>Dounce 균질화기를 2mL의 차가운 신경 세포 배지 1배로 헹구고 샘플을 400× g 에서 8분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 부드러운 피펫팅을 통해 펠릿을 500μL의 얼음처럼 차가운 DPBS에 재현탁시킵니다. 균질한 현탁액을 보장하고 DPBS를 사용하여 최종 부피를 1.5mL로 완성합니다.</li>
	<li>500 μL의 등장성 Percoll 용액을 샘플에 추가하고 부드럽게 재현탁 한 다음 다른 2ml의 차가운 DPBS로 오버레이합니다.</li>
	<li>3,000× g 에서 브레이크 없이 최대 가속으로 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 중간 단계에서 최상층과 미엘린 디스크를 흡인합니다. 알림: 다음의 모든 원심분리 단계는 달리 지정되지 않은 경우 4 °C에서 수행됩니다.</li>
	<li>4mL의 차가운 DPBS를 추가하고 샘플을 400× g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 100μL의 고정 가능한 생존도 염색 용액에 세포를 재현탁시키고 4°C에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>시료에 1mL의 차가운 DPBS를 추가하고 시료를 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 100μL의 CD16/CD32 염색 용액(FACS 완충액의 1/200)을 추가합니다. ~5초 동안 소용돌이치고 4°C에서 10분 동안 배양합니다. 참고: CD16/CD32 염색은 유세포 분석과 같은 응용 분야에 앞서 미세아교세포와 같은 FcR 보유 세포에 대한 항체의 비특이적 결합을 최소화하기 위한 전처리입니다.</li>
	<li>FACS 완충액 1mL를 시료에 넣고 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 100μL의 염색 마스터 믹스-I(1x FACS 버퍼에 1/100 anti-CD11b/ anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C/ anti-Ly6G)를 추가합니다. 어두운 곳에서 4°C에서 20분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>FACS 완충액 1mL를 시료에 넣고 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>펠릿을 250μL의 고정 완충액에 재현탁시킵니다. 4 °C에서 25분 동안 배양합니다.</li>
	<li>1x 투과성(PERM) 완충액 2mL를 넣고 300× g 을 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 100 μL의 vGLUT1 또는 isotype control staining solution을 첨가한다. ~5초 동안 소용돌이치고 4°C에서 50분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>1x PERM 버퍼 2mL를 넣고 300× g 을 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 2mL의 FACS 완충액을 샘플에 추가합니다.</li>
	<li>300× g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 250 μL의 FACS 버퍼에 세포를 재현탁시키고 40 μm 스트레이너 필터를 통해 샘플을 통과시킵니다.</li>
	<li>유세포 분석을 사용하여 단일/생존/CD11b++/CD45+ 미세아교세포에서 vGLUT1 형광 강도를 분석합니다. 각 실험에 대한 음성 대조군으로 비장 대식세포를 사용합니다.<ol><li>70μm 여과기 필터를 통해 다진 비장 조직을 두 번 부드럽게 압박하여 비장 세포를 분리합니다. 40mL의 DPBS로 필터를 헹구고 50mL 원뿔형 튜브에 현탁액을 수집합니다.</li>
		<li>350 × g 을 10분 동안 원심분리하고 결과 펠릿을 적혈구 용해 완충액 1mL 용액에 재현탁시킵니다. 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>배양 후 샘플에 DPBS 10mL를 추가하고 350× g 에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>1.11단계와 1.17단계 사이에 설명된 염색 단계를 진행합니다. 참고: 게이팅 전략은 비장 대식세포를 CD11b ++/ CD45 ++/ Viable cell population으로 정의하기 위해 보충 그림 S2에 제공됩니다.</li>
		<li>게이팅 전략(그림 1)<ol><li>기본 게이트: 전방 산란 영역(FSC-A) [x축] 및 측면 산란 영역(SSC-A) [y축]을 조정하여 게이트 영역에 미세아교세포 집단을 포함하고 세포 파편을 제외합니다.</li>
			<li>전방 산란 영역(FSC-A) [x축] 및 전방 산란 높이(FSC-H) [y축]를 조정하여 이중선을 제외합니다. 단일항은 이 점도표에서 대각선으로 나타납니다.</li>
			<li>CD11b-PECy7[y축] 및 CD45-APC[x축]를 조정하고 CD11b의 높은 표면 수준과 중간 수준의 CD45를 미세아교세포로 게이트합니다.</li>
			<li>FITC[y축] negative gate에서 데드 셀을 제외합니다. 선택 사항: 또한 FITC 음성 게이트에서 Ly6C- 및 Ly6G-FITC에 양성인 세포를 제외하여 CNS 관련 대식세포를 분석에서 제외합니다. 참고: 살아있는 세포와 달리, 막이 손상된 죽은 세포는 고정 가능한 생존력 염료가 세포질에 들어갈 수 있도록 하여 단백질 라벨링의 양을 증가시킵니다18. 따라서, 죽은 세포는 정의된 게이트에 포함된 살아있는 세포보다 더 밝을 것입니다.</li>
			<li>CD45-APC [x 축] 및 vGLUT1-PE [y 축]을 조정하십시오. 비장 샘플에서 양성 사건이 감지되지 않은 임계값 게이트 이상의 모집단(내부 생물학적 음성 대조군, 그림 1E)은 샘플에서 vGLUT1 양성 분율로 간주됩니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. 미세아교세포(microglia)에 의한 미처리 시냅토솜(crude synaptosome)의 in vitro engulfment 검출
<ol><li>조잡한 시냅토좀 조제 및 pHrodo Red 라벨링 알림: 다음 단계는 모두 얼음 위에서 수행해야 합니다.<ol><li>1.1에서 1.2까지 수행합니다.</li>
		<li>얼음처럼 차가운 신경 세포 배지 1mL로 채워진 페트리 접시에 뇌를 옮기고 해마를 조심스럽게 해부합니다. 페트리 접시는 항상 얼음 위에 두십시오. 다음 단계에서 미세아교세포 분리를 위해 해마를 사용하십시오.</li>
		<li>뇌의 나머지 부분(소뇌 및 후각구 제외)을 시냅스 단백질 추출 시약 1mL로 채워진 Dounce 균질화기로 옮기고 느슨한 유봉을 사용하여 약 ~30번의 타격으로 조직을 부드럽게 해리합니다. 추출 시약 10mL당 프로테아제 억제제 1정을 보충하고 제조업체의 지침에 따라 시냅토솜을 분리합니다. 참고: SynPER19와 같은 시냅스 단백질 추출 시약은 생물학적으로 활성화된 시냅스 전 및 시냅스 후 단백질을 포함하는 시냅토솜을 준비하는 데 사용됩니다.</li>
		<li>조잡한 시냅토솜 펠릿을 500μL의 0.1M Na2CO3 용액에 용해시킵니다. 시냅토솜 샘플에 10μL의 0.2mM pHrodo Red를 염색합니다. 조잡한 시냅토솜 샘플을 실온(24-25°C)에서 1.5시간 동안 부드럽게 교반하여 배양합니다.</li>
		<li>샘플에 1mL의 차가운 DPBS를 추가하고 최고 속도(20,815 × g)로 1분 동안 원심분리한 다음 상층액을 흡인합니다.</li>
		<li>샘플에서 결합되지 않은 과도한 pHrodo Red를 제거하기 위해 총 7x에 대해 2.1.5단계를 반복합니다.</li>
		<li>마지막 원심분리기 후 표준 BCA 분석을 수행하여 샘플의 단백질 농도를 정량화합니다.</li>
		<li>선택 사항: 액체 질소를 사용하여 5% DMSO가 있는 DPBS의 시냅토솜 샘플을 스냅 동결하고 -80°C에서 3주 동안 보존합니다. 빛 노출을 최소화하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 덮으십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>In vitro 갓 분리된 성인 미세아교세포를 사용한 조잡한 시냅토솜 삼킴 분석<ol><li>aCSF를 준비하고 30분 동안 95% O2:5%CO2 와 평형을 이룹니다. 알림: 2.2.2-2.2.4 단계의 경우 파파인 기반 소화 용액 준비에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.</li>
		<li>파파인 키트의 바이알 2 에 aCSF 4mL를 추가합니다. 파파인 용액이 맑아질 때까지 바이알을 37°C 수조에 ~10분 동안 넣습니다.</li>
		<li>파파인 키트의 바이알 3 에 aCSF 400μL를 추가합니다. 느린 피펫팅으로 ~10회 부드럽게 혼합합니다.</li>
		<li>바이알 3에서 바이알 200μL를 바이알 2에 추가합니다(2.2.3단계에서 재구성). 바이알의 나머지 부분을 보관합니다 3.</li>
		<li>2.1.2단계에서 해부한 해마를 메스를 사용하여 절개된 해마를 다집니다.</li>
		<li>다진 해마를 2.2.5단계에서 준비한 효소 용액 2mL로 채워진 조직 해리 튜브에 옮깁니다. 튜브를 조직 분리기에 넣고 프로그램을 실행합니다: 37C_ABDK_01 (~30분 소요).</li>
		<li>샘플을 37°C의 수조에 ~20분 동안 넣고 기포를 만들지 않고 5mL 피펫을 사용하여 1분마다 혼합물을 삼중 추출합니다. 알림: 이 과정은 조직이 완전히 해리되고 효율적인 해리를 보장하기 위해 완전히 균질하게 나타날 때까지 계속해야 합니다. 뒤따르기의 모든 원심분리 단계는 달리 명시되지 않는 경우 4 °C에서 수행된다.</li>
		<li>새 15mL 튜브에서 탁한 세포 현탁액을 조심스럽게 제거하고 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>이 5분 동안 샘플당 다음 세척 혼합물(5mL)을 준비합니다. 파파인 키트에 제공된 재구성된 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액 500μL를 aCSF 4.5mL에 추가합니다. 2.2.5단계에서 바이알 3에 남아 있는 용액을 세척 혼합물에 추가합니다.</li>
		<li>2.2.8 단계에서 상층액을 버리고 즉시 세포 펠릿을 세척 혼합 용액에 재현탁시킵니다.</li>
		<li>70μm 필터를 통해 샘플을 새 5mL 미세 원심분리 튜브에 넣습니다. 샘플을 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>이전에 1.7-1.9단계에서 설명한 Percoll 그래디언트 원심분리 단계를 진행합니다.</li>
		<li>위아래로 천천히 피펫팅하여 MACS 염색 완충액에 세포를 조심스럽게 재현탁시킵니다. 4°C에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>각 샘플에 MACS 완충액 1mL를 추가하고 300× g 에서 8분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>500μL의 MACS 버퍼에 셀을 재현탁합니다.</li>
		<li>자기 분리기에 포지티브 선택 열을 배치합니다. 3mL의 MACS 버퍼로 컬럼을 헹구어 평형을 유지합니다.</li>
		<li>500 μL의 셀 현탁액을 부드럽게 혼합하여 컬럼에 적용합니다. 3mL의 MACS 버퍼로 컬럼을 3번 세척합니다.</li>
		<li>자기 분리기에서 컬럼을 제거하고 15mL 코니컬 튜브에 놓습니다. 5mL의 MACS 완충액을 컬럼에 추가하고 플럼퍼를 사용하여 세포를 즉시 씻어냅니다. 샘플을 300× g 에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>이 기간 동안 DPBS에서 20% FBS 40mL를 준비합니다. 수조에서 시료당 1mL의 DMEM을 최대 37°C까지 예열합니다.</li>
		<li>최종 세포 펠릿을 예열된 DMEM 1mL에 용해시킵니다. 약 150,000-200,000개의 세포를 24웰 플레이트의 웰당 500μL의 예열된 DMEM에 파종합니다. 대조군으로, 1-2개의 추가 웰에 비슷한 수의 세포를 파종합니다. 광학 현미경을 사용하여 모든 웰에 있는 세포의 밀도를 확인하십시오. 참고: 대상 뇌 영역이 해마이거나 비교적 작은 뇌 영역인 경우 샘플(n)당 5마리의 마우스를 모아 ~150,000개의 미세아교세포를 분리할 수 있습니다. 전체 뇌의 경우, n당 1마리의 마우스는 두 가지 격리 프로토콜을 모두 사용하여 비슷한 수의 세포를 얻기에 충분합니다. 또는 ~40,000개의 세포를 100μL 최종 부피의 96웰 플레이트에 도금하여 삼킴 분석을 시작할 수 있습니다. 이렇게 하면 분석되는 세포의 수가 줄어들지만 n개당 사용되는 마우스의 수도 줄어듭니다. DMEM에서 FCS의 부족으로 인한 단백질 결핍은 식세포작용을 유발합니다.</li>
		<li>인큐베이터(37 °C 및 5% CO2)에서 1-2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 참고: 이 단계는 기능적 삼킴 분석을 시작하기 전에 세포가 분리 절차의 스트레스 취약 효과로부터 회복되는 것을 목표로 합니다.</li>
		<li>각 웰에서 250μL의 배지를 매우 천천히 꺼내고, 각 웰에 250μL의 신선하고 예열된 DMEM을 추가하고, 상단에 3μg의 pHRodo Red 라벨 시냅토솜을 추가합니다. 광학 현미경을 사용하여 모든 웰의 세포 밀도를 확인하십시오.<ol><li>negative control well의 경우, 세포가 파종된 여분의 well에 동일한 양의 라벨링되지 않은 시냅토솜을 추가합니다.</li>
			<li>테스트 웰의 경우 웰 1에 셀만 포함되어 있는지 확인합니다. 웰 2는 세포 + 표지되지 않은 시냅토솜을 포함합니다. well-3에는 세포 + 3μg의 pHrodo Red가 포함되어 있습니다. 웰 4에는 DMEM + 3μg의 pHrodo Red가 포함되어 있습니다.</li>
		</ol></li>
		<li>인큐베이터(37 °C 및 5% CO2)에서 2시간 동안 시냅토솜으로 세포를 배양합니다.</li>
		<li>매체를 꺼내고 차가운 DPBS로 우물을 씻으십시오. 웰당 200μL의 Trypsin/EDTA 용액을 추가하여 35초 동안 세포를 분리합니다.</li>
		<li>웰당 DPBS에 1mL의 40% FBS를 추가하고 여과기를 통해 세포를 5mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 이 과정에서 플레이트와 튜브를 모두 얼음 위에 두어 세포의 분리를 용이하게 합니다.</li>
		<li>2μL의 얼음처럼 차가운 DPBS를 사용하여 각 웰을 500번 세척합니다. 수집된 샘플을 500× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>100μL의 FACS 완충액에 1/200 CD16/CD32를 함유한 염색 용액에 세포를 재현탁시키고 얼음에서 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>배양 후 CD11b 및 CD45를 각각 1/100의 최종 농도로 염색 용액에 추가합니다. 어두운 곳에서 4 °C에서 20 분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>FACS 완충액 1mL로 시료를 세척하고 300× g 에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>펠릿을 250μL의 FACS 완충액에 재현탁시키고 유세포 분석을 사용하여 최소 100,000개의 총 이벤트를 기록합니다. CD11b++/CD45+ 미세아교세포에서 pHrodo Red 형광 강도를 분석합니다.</li>
		<li>게이팅 전략(그림 2C)<ol><li>기본 게이트 조정: 전방 산란 영역(FSC-A) [x축] 및 측면 산란 영역(SSC-A) [x축]을 조정하여 게이트 영역에 미세아교세포 집단을 포함하고 세포 파편을 제외합니다.</li>
			<li>전방 산란 영역(FSC-A) [x축] 및 전방 산란 높이(FSC-H) [y축]를 조정하여 이중선을 제외합니다. 단일항은 이 점도표에서 대각선으로 나타납니다.</li>
			<li>CD11b-PECy7[y축] 및 CD45-APC[x축]를 조정하고 표면 수준이 높은 CD11b 및 중간 수준의 CD45를 가진 집단을 미세아교세포로 게이트합니다.</li>
			<li>이 모집단에서 pHrodo-PE의 형광 강도 중앙값을 계산합니다. 라벨링되지 않은 시냅토솜으로 배양된 동일한 세포를 음성 대조군으로 사용합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴을 위한 유세포분석 기반 분석

<ol>
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D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+the+hippocampus+in+neurodegenerative+diseases.">Structural plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (6), 3349 (2022).</li><li>Aw, E., Zhang, Y., Carroll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+responses+to+peripheral+type+1+interferon.">Microglial responses to peripheral type 1 interferon.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 340 (2020).</li><li>Brioschi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+synaptic+proteins+in+microglia+by+flow+cytometry.">Detection of synaptic proteins in microglia by flow cytometry.</a> Front Mol Neurosci. 13, 149 (2020).</li><li>Norris, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+integrity+and+complement+control+synaptic+material+clearance+by+microglia+after+CNS+injury.">Neuronal integrity and complement control synaptic material clearance by microglia after CNS injury.</a> JEM. 215 (7), 1789-1801 (2018).</li><li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations.">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 7944 (2020).</li><li>Jaszczyk, A., Stankiewicz, A. M., Juszczak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+mouse+hippocampus+with+its+dorsal,+intermediate+and+ventral+subdivisions+combined+with+molecular+validation.">Dissection of mouse hippocampus with its dorsal, intermediate and ventral subdivisions combined with molecular validation.</a> Brain Sci. 12 (6), 799 (2022).</li><li>Fixable viability dyes for flow cytometry. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html</a> (2024)</li><li>SynPER synaptic protein extraction reagent. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P</a> (2024)</li><li>Wu, A., Yu, B., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+olfactory+bulb+circuits.">Plasticity in olfactory bulb circuits.</a> Curr Opin Neurol. 64, 17-23 (2020).</li><li>pHrodo indicators for pH determination. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html</a> (2024)</li><li>Rangaraju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phagocytic+properties+of+CD45low+microglia+and+CD45high+brain+mononuclear+phagocytes-activation+and+age-related+effects.">Differential phagocytic properties of CD45low microglia and CD45high brain mononuclear phagocytes-activation and age-related effects.</a> Front Immunol. 9, 405 (2018).</li><li>Weinhard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+remodel+synapses+by+presynaptic+trogocytosis+and+spine+head+filopodia+induction.">Microglia remodel synapses by presynaptic trogocytosis and spine head filopodia induction.</a> Nat Commun. 9 (1), 1228 (2018).</li><li>Morizawa, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+through+glial+synapse+engulfment+upon+motor+learning.">Synaptic pruning through glial synapse engulfment upon motor learning.</a> Nat Neurosci. 25 (11), 1458-1469 (2022).</li><li>Morini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+studying+microglial-mediated+synapse+elimination+and+refinement.">Strategies and tools for studying microglial-mediated synapse elimination and refinement.</a> Front. Immunol. 12, 640937 (2021).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry. Part A: J. Int Soc Anal Cytol. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>. Strategies for intracellular flow cytometry success Available from: <a target="_blank" href="https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/">https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/</a> (2022)</li><li>. Isotype control antibodies, Key points Available from: <a target="_blank" href="https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used">https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used</a> (2024)</li><li>Flow cytometry intracellular staining controls. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html</a> (2024)</li><li>Dissing-Olesen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEAST:+A+flow+cytometry-based+toolkit+for+interrogating+microglial+engulfment+of+synaptic+and+myelin+proteins.">FEAST: A flow cytometry-based toolkit for interrogating microglial engulfment of synaptic and myelin proteins.</a> Nat Commun. 14, 6015 (2023).</li><li>Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+general+and+discriminating+markers+of+differential+microglia+phenotypes.">Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes.</a> Front Cell Neurosci. 14, 198 (2020).</li><li>van Wageningen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+microglial+TMEM119+and+P2RY12+immunoreactivity+in+multiple+sclerosis+white+and+grey+matter+lesions+is+dependent+on+their+inflammatory+environment.">Regulation of microglial TMEM119 and P2RY12 immunoreactivity in multiple sclerosis white and grey matter lesions is dependent on their inflammatory environment.</a> Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 206 (2019).</li></ol>

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

미세아교세포-시냅스 상호작용을 통한 시냅스 정제는 신경면역학 분야의 흥미로운 연구 분야로, 신경퇴행성 및 신경 발달 장애에서 미세아교세포의 역할에 대한 유망한 통찰력을 제공합니다. 2011년; Paolicelli et al.은 미세아교세포 내에 시냅스 물질이 존재한다는 증거를 제공하여 시냅스 집피 과정에 대한 그들의 관여를 밝혔다4. 또 다른 흥미로운 연구에서는 타임랩스 이미징과 체외 기관형 뇌 절편 배양 모델을 사용하여 미세아교세포가 트로고사이토시스(trogocytosis)로 알려진 식세포 과정에 참여하여 전체 시냅스 구조가 아닌 시냅스전 구조를 침범한다고 보고했습니다23. 온전한 조직에서 식세포작용을 측정할 수 있는 새로운 형질전환 마우스 모델을 사용한 매우 최근의 간행물에서는 운동 학습에 대한 Bergmann-glia 의 생체 내 가지치기(pruning)를 보여주었습니다24. 따라서, 미세아교세포(microglia)를 포함한 시냅스 내막(synaptic engulfment)에 신경교세포(glial cell)가 관여한다는 충분한 증거가 있다. 그러나 이 미세아교세포(microglial function)가 시냅스 가지치기(synaptic pruning)의 동적이고 선택적인 과정에 영향을 미치는 정도는 추가적인 증거를 필요로 한다.
그럼에도 불구하고, 시냅스의 미세아교세포의 삼킴의 정량화는 귀중한 지표 역할을 하며 미세아교세포-시냅스 상호 작용, 특히 시냅스 정제의 복잡한 역학에 대한 부분적인 통찰력을 제공합니다. 종합적인 검토는 시냅스25의 미세아교세포(microglia engulfmentment)를 조사하는 데 사용되는 현재 프로토콜을 요약했다. 우리는 우리의 프로토콜이 이미 사용 중인 기존 프로토콜을 기반으로 최적화되어 있다는 점을 강조하고 싶습니다. 이 연구에서 제시된 방법은 다양한 절개된 뇌 영역에서 시냅스의 빠르고 처리량이 높은 정량화, 미세아교세포 삼킴을 제공합니다. 뇌 영역에 따라 두 방법 모두 최대 2일 동안 최소 10,000개의 미세아교세포를 분석할 수 있어 여러 마우스 모델을 병렬로 테스트하는 데 유용합니다.
우리는 vGLUT1+ 미세아교세포의 정량화가 in vivo 및 고정 단계까지의 단기 ex vivo 삼킴으로 구성됨을 인정한다. 따라서 당사의 분석은 IHC와 같은 접근 방식을 사용하여 생체 내 검증 이전의 초기 단계로 미세아교세포 내부의 시냅스 물질을 정량화하는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제시할 것을 제안합니다.
유세포 분석 분석의 또 다른 단점은 시냅스 마커, 특히 억제성 시냅스에 대한 항체의 가용성이 제한적이라는 것입니다. 이러한 마커에 대한 밝은 신호를 보여주는 상업적으로 이용 가능한 직접 접합 항체를 찾는 것은 어렵습니다. 시냅스 마커를 표적으로 하는 다양한 항체를 테스트하는 데 필요한 광범위한 최적화 시간을 감안할 때, 이 연구에서와 같이 다양한 항체를 사용한 세포 내 염색을 위해 잘 최적화된 절차를 과학계와 공유하는 것이 중요합니다.
이 연구의 데이터 분석과 관련하여, 우리는 vGLUT1 항체의 비특이적 결합을 설명하기 위해 기술적 음성 대조군으로 Isotype 대조군을 사용했는데, 이는 유세포분석 기반 분석을 최적화하면서 샘플에서 항체의 비특이적 결합에 대한 추정치를 제공하기 때문입니다26. 그러나, 이소타입 대조군은 대부분 표면 염색 절차로부터 비특이적 배경 신호를 검출하도록 최적화되어 왔으며, 세포내 염색 대조군에는 최적이 아니다(27,28). 따라서 항원 검출, 자가형광 및 형광단 밝기에 영향을 줄 수 있는 고정 및 투과화 단계를 포함하는 세포 내 염색을 수행할 때 음성 집단과 양성 집단을 구별하는 데 의존해서는 안 됩니다29. 이러한 세포내 염색 절차는 세포내 마커(29)에 대해 염색된 양성 세포 집단을 정의하기 위해 적절한 생물학적 내부 대조군의 사용을 필요로 한다. 따라서 세포 내 염색 프로토콜을 사용한다는 점을 고려하여 내부 생물학적 음성 대조군(비장 대식세포)을 사용하고 동일한 마우스에서 분리된 비장 대식세포에 따라 양성 개체군과 음성 개체군 사이의 경계를 정의했습니다. 우리는 vGLUT1 양성 사건이 없는 게이트 위의 양성 개체군과 생물학적 음성 대조군 역할을 하는 비장 대식세포를 구별했습니다(그림 1).
이 연구에서 제시된 두 가지 방법 모두 빠르고 처리량이 높은 방식으로 시냅스의 미세아교세포 삼킴에 대한 초기 분석에 큰 잠재력을 제공하며, 작은 뇌 영역에서 10,000개 이상의 세포를 분석할 수 있으며 이는 표준 현미경 기술로는 달성할 수 없습니다. 따라서 이러한 방법은 노동 및 시간 집약적인 방법에 비해 상당한 이점을 제공하며 더 많은 수의 미세아교세포를 분석할 수 있도록 하여 시냅스 삼킴에 대한 보다 포괄적인 분석을 제공합니다. 또한 이 연구에서 제시된 시험관 내 방법은 시냅스의 미세아교세포에 대한 다양한 치료법의 영향을 테스트하는 데 특히 유용합니다. 이를 통해 다른 세포 유형과 관련된 교란 요인 없이 미세아교세포에 대한 치료 효과를 직접 정량화할 수 있습니다. 또한, 이는 시냅스 삼킴 과정에 대한 미세환경 또는 다른 세포 유형의 잠재적 영향을 입증하는 간접적인 접근 방식 역할을 합니다. 따라서 우리는 이러한 방법, 특히 병렬로 사용할 때 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 분석을 위한 직관적이고 유리한 대안을 제공한다는 결론을 내렸습니다.
그러나 FACS 기반 phagocytic assay ex vivo 에 의한 갓 분리된 미세아교세포의 분석은 몇 가지 단점을 제기할 수 있습니다. 첫째, 미세아교세포의 체외 활성화 및 스트레스 반응을 피하면서 성인 뇌에서 갓 분리된 미세아교세포를 생성하는 최적화된 프로토콜을 사용하는 것이 중요합니다. Dissing-Olesen et al.은 37 oC30에서 조직 해리 절차를 사용함으로써 이 문제를 극복하기 위해 전사 및 번역 억제제의 사용을 통합했습니다. 반면에 Mattei et al.은 스트레스 관련 유전자16 의 생체 외 발현을 유도하지 않기 위해 차갑고 기계적인 조직 해리 프로토콜을 제시했으며, 세포 내 vGLUT1 염색 전에 스트레스 관련 미세아교세포 반응의 생체 외 활성화를 피하기 위해 첫 번째 섹션에서 이 프로토콜을 조정했습니다. 우리는 파파인 기반 조직 해리 후 미세아교세포의 더 높은 수율을 고려하여 시험관 내 시냅토솜 삼킴 분석 전에 두 번째 섹션에서 효소 조직 해리 프로토콜을 사용했습니다(데이터는 표시되지 않음). 미세아교세포는 시냅토솜으로 배양할 때 배양 조건에서 필연적으로 37 °C로 유지되며, 37 °C에서 배양은 실제로 모든 시험관 내 분석 및 세포 배양 절차의 일반적인 단점으로 미세아교세포의 변화를 유도할 수 있습니다. 따라서, 우리는 시냅스의 미세아교세포(microglial engulfment) 측면에서 더 넓은 결론에 도달하기 위해 제시된 두 프로토콜을 병렬로 사용할 것을 제안합니다.
또한, 이러한 마커를 발현하는 뇌 실질에 있는 다른 면역 세포의 존재를 고려하여 CD11b++/CD45+ 미세아교세포를 선택하기 위한 게이팅 전략을 신중하게 정의하는 것이 중요하다31. 더욱 중요한 것은, 미세아교세포(예: TMEM119, P2RY12)를 특이적으로 표적으로 하는 마커를 선택할 때, 병리학적 및 염증성 상태(32) 동안 이들이 발현 수준의 변화를 겪을 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요하며, 이러한 변화는 시냅스의 미세아교세포 삼킴을 정량화하기 위한 FACS 패널을 구축하기 전에 고려되어야 한다. 마지막으로, IHC 및 현미경 기반 in vivo 접근법을 포함하여 앞서 논의된 방법 중 어느 것도 단독으로는 미세아교세포에 의한 시냅스의 능동적이고 선택적인 가지치기를 포착할 수 없다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 이러한 방법은 미세아교세포에 의한 능동적 가지치기와 뇌실질 내의 시냅스 파편의 수동적 청소를 구별할 수 없습니다. 따라서 데이터를 평가하고 논의할 때 이러한 고유한 개념을 명확하게 구분해야 합니다.

미세아교세포는 중추신경계(CNS)1에 상주하는 면역 세포입니다. 그들은 지속적으로 미세 환경을 스캔하고 감시 1,2를 제공합니다. 더욱이, 그들은 자주 시냅스와 상호 작용하고 시냅스 활동의 미세 조정을 중재합니다3. 따라서 그들은 시냅스 정제 과정에서 핵심 플레이어로 부상했습니다.
시냅스의 삼킴을 통한 시냅스 정제에서 미세아교세포의 역할은 다양한 연구 그룹에 의해 입증되었습니다 3,4,5,6,7. 이 과정에서의 중단은 정신분열증 및 알츠하이머병과 같은 신경발달 및 신경퇴행성 장애의 병리학에 기여할 수 있다8. 미세아교세포에 의한 비정상적인 시냅스 정교화는 이미 신경학적 장애 5,9,10의 다양한 쥐 모델에서 발견되었다. 따라서 시냅스의 미세아교세포(microglial engulfment)의 기저에 있는 뚜렷한 기전을 규명하는 것은 신경발달 및 신경퇴행성 장애의 병태생리학을 이해하는 데 가장 중요하다8.
시냅스의 미세아교세포를 표적으로 삼키는 것은 질병 진행에 개입하고 신경 발달 및 신경 퇴행성 장애의 기전에 대한 통찰력을 얻을 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 조사를 용이하게 하려면 빠르고 처리량이 많은 접근 방식이 필요합니다. 현재의 방법론적 접근법은 in vivo, ex vivo 및 in vitro assay를 포함하며, 이를 통해 미세아교세포 내에서 시냅스 물질을 검출할 수 있습니다. 일반적으로 시냅스의 미세아교세포를 삼키는 검출은 면역조직화학(IHC) 및 현미경 기반 접근법 5,6,11에 크게 의존하는데, 이는 노동 집약적이며 많은 수의 미세아교세포를 분석하는 데 한계가 있습니다.
이러한 기술적 한계를 감안할 때 대체 방법론을 모색하는 것이 필수적입니다. 이를 극복하기 위해 당사는 유세포 분석 기반 접근법을 최적화했으며, 이를 통해 시냅스의 미세아교세포에 대한 효율적이고 편향되지 않은 고처리량 분석을 가능하게 합니다. 우리는 해마를 높은 수준의 시냅스 리모델링과 가소성(plasticity)12 때문에 주요 관심 영역으로 선택했지만, 이 프로토콜은 다양한 뇌 영역에 적용할 수 있습니다. 유세포 분석은 이미 이전 연구에서 시냅스 13,14,15의 미세아교세포 삼킴을 검출하는 데 사용되었지만, 여기서는 현재 상용화된 형광단 접합 vGLUT1 항체를 사용하는 단계별 방법론을 제공합니다. 또한, 당사는 미처리 시냅토솜을 사용하여 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 보완적인 in vitro 접근법을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Dounce Homogenizer</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>Cat# 40401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat# 0030119452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11b</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 25-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 559864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6C</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 553104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 551460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Cat# 23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16/CD32 Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#14-0161-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixable viability dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# L34969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# A1247501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS-columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>Cat# 17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11339283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodoRed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# P36600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>Cat# 5892970001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat# 11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop E-GP Sterile Filtration System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# SEGPT0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynPer Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 87793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGLUT1 Antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-120-764</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of microglial engulfment of synaptic material using flow cytometry

미세아교세포는 뇌의 시냅스 정교에 중추적인 역할을 합니다. 시냅스의 미세아교세포(microglial engulfment)에 대한 분석은 이 과정을 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 면역조직화학(IHC) 및 이미징과 같이 시냅스의 미세아교세포를 식별하기 위해 현재 사용 가능한 방법은 힘들고 시간이 많이 걸립니다. 이 문제를 해결하기 위해 여기에서는 유세포 분석을 사용하여 시냅스의 미세아교세포 삼킴을 빠르고 고처리량으로 정량화할 수 있는 in vitro 및 in vivo* 분석을 제시합니다.
in vivo* 접근법에서는 미세아교세포에 의한 vGLUT1+ 시냅스의 침식을 정량화하기 위해 성체 쥐의 뇌에서 신선한 세포 분리 후 세포 내 vGLUT1 염색을 수행했습니다. in vitro synaptosome engulfment assay에서는 성인 마우스 뇌에서 갓 분리한 세포를 사용하여 미세아교세포에 의한 pHrodo Red 표지 시냅토솜의 삼킴을 정량화했습니다. 이러한 프로토콜은 시냅스의 미세아교세포 삼킴을 정량화하기 위한 시간 효율적인 접근 방식을 제공하며 노동 집약적인 이미지 분석 기반 방법에 대한 유망한 대안을 나타냅니다. 분석을 간소화함으로써 이러한 분석은 다양한 질병 모델에서 시냅스 정제에서 미세아교세포의 역할을 더 잘 이해하는 데 기여할 수 있습니다.

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS)1. They constantly scan their microenvironment and provide surveillance1,2. Moreover, they frequently interact with synapses and mediate a fine-tuning of the synaptic activity3. Thus, they have emerged as a key player in the process of synaptic refinement.
The role of microglia in synaptic refinement through the engulfment of synapses has been shown by various research groups3,4,5,6,7. Disruptions in this process can contribute to the pathology of neurodevelopmental and neurodegenerative disorders such as schizophrenia and Alzheimer&#39;s disease8. Aberrant synaptic refinement by microglia has already been detected in various murine models of neurological disorders5,9,10. Therefore, identification of distinct mechanisms underlying microglial engulfment of synapses is paramount to understanding the pathophysiology of neurodevelopmental and neurodegenerative disorders8.
Targeting microglial engulfment of synapses holds great potential for both intervening in disease progression and gaining insights into the underlying mechanisms of neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. To facilitate such investigations, there is a need for fast and high-throughput approaches. Current methodological approaches encompass in vivo, ex vivo, and in vitro assays that enable the detection of synaptic material within microglia. Generally, the detection of microglial engulfment of synapses relies heavily on immunohistochemistry (IHC) and microscopy-based approaches5,6,11, which are labor-intensive and show limitations in analyzing a large number of microglia.
Given these technical limitations, the exploration of alternative methodologies is imperative. To overcome this, we have optimized a flow cytometry-based approach, which enables an efficient, unbiased, and high-throughput analysis of microglial engulfment of synapses. We chose the hippocampus as the main region of interest due to its high degree of synaptic remodeling and plasticity12, but the protocol can be adapted to various brain regions. While flow cytometry has already been used in previous studies to detect microglial engulfment of synapses13,14,15, we herein provide a step-by-step methodology employing a currently commercially available, fluorophore-conjugated vGLUT1 antibody. We, moreover, provide a complementary&#160;in vitro approach for high-throughput screening of microglial engulfment of synaptic material by using crude synaptosomes.

저자 스포트라이트: 정신신경면역학의 기술 혁신을 통한 이해 증진

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

이 프로젝트에서 우리는 미세아교세포에 의한 시냅스의 in vivo* 및 in vitro engulfment를 측정하기 위한 두 가지 프로토콜을 최적화하고 제시했습니다. 첫 번째 프로토콜에서는 vGLUT1 양성 시냅스의 in vivo* engulfment에 초점을 맞췄습니다. 시작점으로 이전에 게시된 프로토콜14를 사용했습니다. 그러나 이 프로토콜에 사용된 FACS 항체는 단종되었으며 미세아교세포 분리를 위한 새로운 방법뿐만 아니라 많은 최적화 단계를 추가했습니다16. 그렇기 때문에 여기에 제시된 프로토콜은 이미 발표된 프로토콜에 대한 포괄적인 업데이트로 과학계와 공유할 가치가 있습니다.
시냅스의 미세아교세포 삼킴을 정량화하기 위해 11-14주 된 C57BL/6N 수컷 마우스를 사용했습니다. 해마(hippocampus)는 높은 수준의 시냅스 리모델링(synaptic remodeling)과 가소성(plasticity) 때문에 주요 관심 영역으로 선택되었다12. C57BL/6N 마우스의 해마에서 %vGLUT1 양성 미세아교세포와 미세아교세포 특이적 vGLUT1-PE 형광 강도(MFI)를 분석했다. 동일한 동물에서 유래한 비장 대식세포를 실험당 생물학적 음성 대조군으로 사용했습니다. 우리는 isotype 대조군 및 비장 대식세포에 비해 해마 미세아교세포에서 더 높은 vGLUT1-PE 형광 신호를 보여줌으로써 vGLUT1 항체를 테스트했습니다(그림 1B-E)
또한, 우리는 소뇌와 후각구에서 시냅스의 미세아교세포(microglial engulfment)를 비교했습니다(높은 시냅스 가소성에 대한 또 다른 참조로서)20. 우리는 해마에 비해 후구의 미세아교세포에서 더 높은 vGLUT1 형광 신호와 소뇌에서 더 낮은 신호를 발견했습니다(그림 1F). 가장 낮은 신호 강도는 비장 대식세포에서 감지되었으며, 내부 음성 대조군 역할을 합니다(그림 1E). 또한 Vglut-IRES-Cre/ChR2-YFP 마우스를 사용하여 vGLUT1 항체의 면역 활성을 테스트했습니다. YFP는 이 마우스의 글루타마터성 뉴런에 의해 발현되며, 이는 YFP 양성 집단이 vGLUT1 양성 분율도 포함해야 함을 나타냅니다. 이 염색 프로토콜을 사용하여 YFP 양성 집단의 98.7%를 vGLUT1 양성으로 검출하여 항체의 효율성을 검증했습니다(보충 그림 S3).
전반적으로, 이러한 결과는 vGLUT1 항체의 효율성과 제시된 염색 프로토콜의 효과를 입증한다. 우리는 이 프로토콜과 항체를 사용하여 다른 실험적 접근법에 비해 높은 처리량과 빠른 방식으로 시냅스의 in vivo* 삼킴을 자신 있게 정량화하는 데 사용할 수 있음을 입증합니다.
in vitro 분석법으로 넘어가서, 성체 미세아교세포를 분리하고 동일한 동물에서 분리한 신선하게 분리된 pHrodo Red 표지 시냅토솜으로 배양하여 체외 삼킴을 정량화했습니다(그림 2A). 우리는 pH21을 둘러싼 산성에서 형광 신호를 자연적으로 증가시키는 pHrodo Red로 시냅토솜을 표지했습니다. 우리는 시냅토솜을 신선하게 분리하여 다른 pH 값(pH = 4 및 pH = 11)에 노출시켰습니다. 원리 증명 실험(proof-of-principle experiment)으로 낮은 pH에서 형광 신호의 증가를 확인한 후(그림 2B), 이 시냅토솜을 갓 분리한 미세아교세포와 함께 1.5-2시간 동안 배양했습니다. 대조군으로, 우리는 라벨링되지 않은 시냅토솜으로 미세아교세포를 배양했습니다. 다음으로, CD11b++/CD45+ 미세아교세포의 pHrodo Red-PE 형광 신호를 분석하고 pH = 4에서 시냅토솜에서 얻은 것과 유사한 양성 PE 형광을 관찰했습니다(그림 2C). 따라서 이 방법은 시냅토솜의 in vitro engulfment에 대한 빠르고 높은 처리량 분석을 제공하며 필요한 최적화 단계에 따라 아밀로이드 플라크 또는 다른 잠재적 표적의 engulfment로 확장될 수 있습니다. 실제로, Rangaraju et al.은 유사한 유세포 분석 기반 접근법을 사용하여 미세아교세포에 의한 아밀로이드 베타의 침식을 정량화했습니다22. 결론적으로, 이 두 가지 방법은 in vivo* 및 in vitro 모두에서 시냅스의 미세아교세포 삼킴에 대한 강력하고 효율적이며 고처리량 정량화를 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig01v4.jpg"> 그림 1: in vivo *에서 vGLUT1+ 시냅스의 미세아교세포 삼킴 분석.(A) 세포 내 vGLUT1 염색 단계를 묘사한 실험 워크플로우의 그래픽 그림. (B) 해마에서 단일/CD11b++/CD45+/ 생존 가능한 세포 집단을 정의하기 위한 게이팅 전략. 이 집단은 vGLUT1-MFI를 분석하고 해마에서 vGLUT1+ 미세아교세포의 비율을 정량화하는 데 사용되었다. 빨간색 사각형으로 표시된 게이트는 전체 샘플에서 vGLUT1+ 세포 분율을 나타냅니다. (C) 히스토그램은 vGLUT1-PE 형광 강도를 나타낸다. (D) 빨간색 사각형으로 표시된 게이트는 Isotype-PE 면역 반응을 나타내는 양성 세포 분획이 없음을 나타냅니다. 히스토그램은 Isotype-PE 형광 강도를 나타냅니다. (E) 빨간색 사각형으로 표시된 게이트는 비장 대식세포에서 vGLUT1-PE 면역 활성을 나타내는 양성 세포 분획이 없음을 나타냅니다. 히스토그램은 vGLUT1-PE 형광 강도를 나타냅니다. 히스토그램에 표시된 게이트는 비장의 vGLUT1-MFI가 끝나는 수준(~104)에서 시작하여 뇌 샘플에서 vGLUT1 양성 분율을 분석하는 데 사용됩니다. (F) 오버레이된 히스토그램은 해마(빨간색), 소뇌(보라색) 및 후각구(연한 파란색)의 비장 대식세포(회색)와 미세아교세포의 PE 형광 강도를 비교한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig02.jpg"> 그림 2: in vitro에서 시냅토솜 시냅스의 미세아교세포 삼킴 분석. (A) in vitro synaptosome engulfment assay의 단계를 묘사한 실험 워크플로우의 그래픽 그림. (B) 두 가지 다른 pH 값에서 배양된 시냅토솜은 pH = 11에서 낮은 pHrodo Red-PE 형광 신호와 pH = 4에서 높은 pHrodoRed-PE 형광 신호를 나타냅니다. (C) 단일/CD11b++/CD45+ 세포 집단을 사용하여 pHrodo Red-PE 형광 강도를 분석했습니다. 염색되지 않은 시냅토솜으로 배양된 미세아교세포를 음성 대조군으로 사용했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 이 프로토콜에 사용된 완충액 및 시약 목록. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_table%201.zip" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S1: 갓 분리된 성인 미세아교세포의 대표 이미지. CD11b+ 미세아교세포의 파파인 기반 조직 해리 프로토콜 및 MACS 기반 분리에 따라 20x 대물렌즈가 있는 광학 현미경을 사용하여 획득한 이미지. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S2: 비장 대식세포를 정의하기 위한 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 FACS 플롯. 비장은 해마에서 시냅스의 미세아교세포 삼킴을 테스트하는 동안 실험 실행당 실험에서 음성 대조군으로 사용되었습니다. 위에 제공된 FACS 플롯은 비장 대식세포를 CD11b++/CD45++/viable population으로 정의합니다. 이 집단은 이 임계값 게이트 위에 있는 뇌 샘플에서 vGLUT1+ 미세아교세포를 정량화하기 위한 임계값을 설정하는 데 사용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-2.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S3: vGLUT1 항체의 효율성을 테스트하기 위한 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 FACS 플롯. (A) vGLUT1 염색 단계를 묘사한 실험 워크플로우의 그래픽 그림. YFP+ 글루타마터성 뉴런을 사용하여 vGLUT1 항체의 면역 활성을 테스트했습니다. (B) vGLUT1 FACS 항체의 효율성을 테스트하기 위한 양성 대조군으로 사용된 Vglut-IRES-Cre//ChR2-YFP 마우스의 해마에서 YFP+ 개체군을 정의하기 위한 게이팅 전략. YFP+ 분획은 글루타마터직 시냅스를 지정하기 위해 게이트되었습니다. 이 집단에서 vGLUT1 항체의 면역 활성을 분석하여 항체의 면역 활성을 테스트하였다. (C) Isotype 컨트롤과 비교; YFP 양성 세포 분획의 97.9%가 (D) vGLUT1 양성으로 검출됩니다. (E) 오버레이된 히스토그램은 isotype과 vGLUT1 항체 간의 PE 형광 비교를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-3.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 유세포 분석을 사용하여 vGLUT1 양성 시냅스 및 pHRodo Red 표지 미처리 시냅토좀의 미세아교세포 삼킴을 정량화하는 두 가지 프로토콜을 제시합니다.

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

우리의 연구 초점은 정신 신경 면역학이며 면역 체계와 뇌 및 마음의 교차점을 조사합니다. 저는 특히 면역 상태에 따라 환자의 하위 그룹을 해독하여 환자를 위한 맞춤형 치료법을 찾는 데 관심이 있습니다. 이 분야의 최근 발전에는 PET 리간드의 개발이 포함되지만 면역 기반 치료법을 해독하기 위한 RNA 염기서열분석, 단세포 RNA 염기서열분석, 공간 RNA 염기서열분석과 같은 첨단 기술도 포함됩니다.당사의 프로토콜은 시냅스 물질의 미세아교세포(microglial engulfment)를 정량화하는 문제를 해결하며, 이는 뇌 기능과 질병 병리학에서의 역할을 이해하는 데 중요합니다. 당사의 프로토콜은 미세아교세포에 의해 휩싸인 시냅스 물질의 빠르고 신뢰할 수 있는 정량화를 제공하므로 미세아교세포의 기능적 활성에 대한 통찰력을 제공합니다. 당사의 프로토콜은 다른 연구 그룹이 삼켜진 모토시냅토솜과 같은 더 많은 기능 분석을 연구에 포함하도록 영감을 줄 것이며, 이는 신경면역 상호 작용에서 미세아교세포의 역할에 대한 더 우수하고 포괄적인 이해를 이끌 것입니다.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

594 조회수.  Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association. 우리의 연구 초점은 정신 신경 면역학이며 면역 체계와 뇌 및 마음의 교차점을 조사합니다. 저는 특히 면역 상태에 따라 환자의 하위 그룹을 해독하여 환자를 위한 맞춤형 치료법을 찾는 데 관심이 있습니다. 이 분야의 최근 발전에는 PET 리간드의 개발이 포함되지만 면역 기반 치료법을 해독하기 위한 RNA 염기서열분석, 단세포 RNA 염기서열분석, 공간 RNA 염기서열분석과 같은 ...

비디오: 저자 스포트라이트: 정신신경면역학의 기술 혁신을 통한 이해 증진

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.