1) Préparation de Drosophila melanogaster jonction musculaire neuronale (JNM) <ol><li> Préparer la norme drosophile salin (130 mM NaCl, 36 mM de saccharose, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, MgCl2 2 mM, 5 mM Hepes, pH 7,3 4. </li><li> Disséquer la préparation dans une solution saline (1,1). Les larves de drosophile se languissait dorsale côte dans un plat Sylgard; sur la face dorsale longitudinale est sectionné, et les organes internes sont enlevés. La préparation est ensuite étiré et se languissait. Plusieurs muscles ventraux peuvent être ensuite utilisées. </li></ol> 2) La stimulation et la coloration FM <ol><li> Il est conseillé de faire toutes les étapes suivantes dans des conditions de faible éclairage, afin de protéger les colorants FM de blanchiment. </li><li> Pour une stimulation chimique des nerfs, un tampon de potassium est utilisé. Préparer la drosophile salin (voir 1.1) contenant 90 mM de KCl et 10 pM de FM1-43 colorant. Conserver la solution abri de la lumière. </li><li> Bain de la préparation avec le tampon préalablement préparé pendant 1 minute à température ambiante. </li><li> Laver à la norme drosophile saline (1.1) pour enlever extracellulaire FM1-43 colorant. Procéder rapidement à la fixation. </li></ol> 3) de fixation <ol><li> Bain de la préparation avec du glutaraldéhyde à 2,5% en tampon phosphate salin (PBS) pendant 45 minutes à température ambiante. Pour une bonne conservation des caractéristiques morphologiques, le glutaraldéhyde est préféré à paraformaldéhyde. </li><li> Laver une fois avec du PBS, puis laissez la préparation immergé pendant 15 minutes dans 100 mM de NH 4 Cl. Cette étape est effectuée afin d&#39;étancher les groupes aldéhydes libres du fixateur glutaraldéhyde restant. </li><li> Laver la solution NH 4 Cl avec la normale du PBS. </li></ol> 4) photoconversion <ol><li> Incuber la préparation JNM pendant 30 minutes à 4 ° C dans du PBS contenant 1,5 mg ml-1 de la diaminobenzidine (DAB). </li><li> Position de l&#39;échantillon sous le microscope à fluorescence. Trouvez et se concentrer le signal de fluorescence en utilisant un objectif de grossissement relativement faible immersion dans l&#39;eau (20x 0,5 NA). </li><li> Eclairer l&#39;échantillon avec l&#39;intensité maximale de la lampe jusqu&#39;à ce que le colorant est complètement blanchi FM (figure 1C). Pour contrôler si photoconversion a eu lieu, est conseillé de vérifier à l&#39;échantillon sous la lumière de transmission avant et après la teinture-blanchiment FM étape. Si photoconversion a lieu, un précipité brun foncé est prévu (figure 1C). Le temps d&#39;éclairage est variable, en fonction de la force d&#39;éclairage et aussi sur la pénétration DAB dans la préparation. Pour la plupart des préparations, nous avons trouvé les temps d&#39;illumination de ~ 30-45 minutes pour être optimale lorsque vous utilisez un objectif 20x. Périodes plus courtes sont l&#39;éclairage utilisé pour des objectifs plus élevés de grossissement (60x). </li><li> Pour l&#39;éclairage, nous préférons utiliser une lampe au mercure, avec un boîtier de lampe contenant un miroir en arrière, qui recueille les faisceaux de lumière rétrodiffusée, et donc augmente l&#39;intensité totale. </li></ol> 5) Traitement de l&#39;échantillon pour EM <ol><li> Osmication <ol class="lalpha"><li> Préparer une solution avec un volume de tétroxyde d&#39;osmium dans le volume des arbres de l&#39;eau (env. 300 ul par échantillon). Le travail en utilisant le tétroxyde d&#39;osmium doit être fait sous le capot, en utilisant des gants et des équipements de protection aye. </li><li> Incuber la préparation de la solution de tétroxyde d&#39;osmium pendant 1 heure à température ambiante (sous le capot). </li><li> Laver abondamment avec du PBS (4-5 fois 5 minutes) et transférer chaque échantillon dans une fiole de verre propre. </li></ol></li><li> Déshydratation <ol class="lalpha"><li> Préparer des solutions séparées contenant 30, 50, 70 90, 95 et 100% d&#39;éthanol. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 30% à chaque échantillon pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 50% à chaque échantillon pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 70% à chaque échantillon pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 90% à chaque échantillon pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 95% à chaque échantillon pendant 5 minutes (répéter 3x). </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 100% à chaque échantillon pendant 5 minutes (répéter 3x). </li></ol></li><li> Intégration et le traitement ultérieur <ol class="lalpha"><li> Mélanger 1 volume d&#39;Epon résine avec un volume d&#39;éthanol. Ajoutez-le à la préparation sous une rotation continue (2-4 heures). </li><li> Placer la préparation dans 100% en Epon flacons ouverts, permettent l&#39;éthanol restant de s&#39;évaporer (4-6 heures). </li><li> Placer la préparation dans des moules à 60 ° C pendant 36 heures. </li><li> Traitement de la microscopie électronique. Processus de la préparation dans 50-80 nm sections minces, en utilisant des procédures ultramicrotomie standard. </li></ol></li><li> Imagerie par microscopie électronique <ol class="lalpha"><li> La préparation est imagée en utilisant les procédures classiques EM. </li></ol></li></ol> 6) Résultats Représentant Les résultats attendus sont décrits dans les figures 1C et 2. La procédure de l&#39;éclairage dans la formation de broprécipitent DAB wn, qui sera visible dans les deux fluorescence et imagerie de transmission. La première occurrence lors de l&#39;illumination est la disparition de la fluorescence associée à la coloration de teinture FM. La fluorescence de fond induit par le fixateur d&#39;aldéhyde, en revanche, sera visible tout au long de l&#39;expérience. Le blanchiment a lieu généralement dans ~ 10-20 minutes après le début de l&#39;illumination. Généralement, aucun produit photoconversion peut être observé à ce point dans le temps. Illumination devrait être poursuivi, et après ~ 10 minutes les préparatifs vont se tourner vers une teinte brune due à l&#39;accumulation de DAB (figure 1C iv) Il est difficile de comprendre pourquoi la DAB et FM précipitations de teinture blanchiment n&#39;ont pas lieu simultanément, il est possible qu&#39;une relativement grande quantité de DAB oxydée doit s&#39;accumuler avant l&#39;agrégation et la précipitation, et que par conséquent, cette réaction est plus lent que le processus de blanchiment. A ce stade, cependant, la préparation n&#39;est pas prêt pour le traitement de la microscopie électronique, que la précipitation est probablement incomplète DAB. Nous préférons attendre 5-10 minutes plus, au cours de laquelle la préparation (terminaison nerveuse présynaptique) suppose un brun foncé (ou noir) de couleur, indiquant une conversion complète. Une conversion légère de la surface générale de la préparation (par exemple, des fibres musculaires dans une jonction neuromusculaire) peut être observée à ce stade. Il est très probablement liée à une conversion des DAB induite par autofluorescence (et / ou de fluorescence fixateur), et il n&#39;est pas préjudiciable à la procédure. La préparation est ensuite traitée pour la microscopie électronique, et doivent être vérifiés pour la présence de l&#39;obscurité (marqué) des vésicules. Comme nous l&#39;avons démontré, avant 5,6, ces vésicules sont beaucoup plus denses que les non-étiquetées petits, et sont donc faciles à distinguer (figure 2B). Pour augmenter les chances de distinguer ainsi les différents types de vésicules, pas d&#39;amélioration du contraste coloration après des sections doit être effectué (pas de coloration ou de l&#39;acétate d&#39;uranyle citrate de plomb), la coloration d&#39;osmium est suffisante pour observer la plupart des éléments cellulaires, et n&#39;est pas aussi sombre que précipiter DAB. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: les colorants FM et de l&#39;utiliser pour photoconversion. (A) représentent les étapes d&#39;une expérience classique pour le chargement et distaining vésicules à l&#39;aide de colorants FM sous stimulation. (I) incuber l&#39;échantillon en FM colorants contenant un tampon. (Ii) stimuler (électriquement ou chimiquement) pour induire la fusion des vésicules en présence de FM colorant. (Iii) L&#39;endocytose séquence après stimulation va charger quelques vésicules avec de la teinture FM toujours présent dans la mémoire tampon extracellulaire. (Iv) Remplacer le colorant extracellulaire FM par un lavage avec du tampon. (V) Une nouvelle stimulation induira vésicules chargées de libérer leurs colorants FM sur l&#39;exocytose. (B) Schéma montrant la tête, le pont et la queue de la teinture FM1-43. (C) Exemple d&#39;une expérience photoconversion chez la drosophile JNM. (I) Après le chargement du JNM par FM1-43, le lavage des molécules de colorant et externes de fixation, la fluorescence d&#39;une terminaison nerveuse peut être observée avec un microscope conventionnel épifluorescence (63x). (II-III) sous illumination continue la teinture est complètement blanchi. (Iv) Lorsque l&#39;éclairage continue, une couleur noire apparaît à cause de précipitations diaminobenzidine. La barre d&#39;échelle représente 10 um. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: EM exemples d&#39;échantillons photoconverted (A) L&#39;image montre une terminaison nerveuse contenant les vésicules synaptiques, mais pas d&#39;entre eux sont photoconverted, ce qui pourrait être causé par ne pas avoir un éclairage suffisant ou la pénétration diaminobenzidine pauvres dans le tissu.. (B) Bouton synaptique avec plusieurs sombres (rempli) des vésicules qui sont passés par photoconversion FM. (C) Excédent des résultats d&#39;illumination globale dans un terminal sombres où aucune des vésicules ou organites sont distinguables. Barres d&#39;échelle représentent 200 nm.

<ol>
	<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li><li>Henkel, A. W., L&#252;bke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals.">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li><li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product.">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li><li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optically+determined+size+of+exo/endo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae.">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li><li>Denker, A., Kr&#246;hnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li><li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles.">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li><li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons.">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li><li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion.">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li><li>Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held.">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li><li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li></ol>

A quelques critiques devraient être prises en compte: <ul><li> L&#39;incubation DAB doit être effectuée uniquement après un lavage soigneux et trempe des préparatifs. Sinon, le glutaraldéhyde n&#39;ayant pas réagi va interagir avec le DAB et provoquer sa précipitation (généralement sous la forme de cristaux plats, qui ne sont pas denses aux électrons). Les préparatifs où cette précipitation a lieu en abondance sont rarement exploitables pour la microscopie électronique. </li><li> Reprises éclairage d...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FM 1-43</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F10317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epon resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plano</td>
<td>R1030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>di-aminobenzidine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AppliChem</td>
<td>A3166</td>
<td>EM grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>104186298</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axioskop 2 FS plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Objective 20x 0.5 NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dry objective</td>
</tr>
<tr>
<td>100W Hg Lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamp housing with back mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>1007-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MRm camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>0445-554</td>
<td>Image acquisition</td>
</tr>
<tr>
<td>Ex. Filter (HQ 470/40)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F49-671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic (495 DCLP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F33-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Em. Filter (HQ 500 LP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F42-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proscan CCD HSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proscan Electronic Sys.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1024 x 1024</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes

La fusion des vésicules synaptiques avec la membrane plasmique (exocytose) est une étape nécessaire dans la libération de neurotransmetteurs et de la communication neuronale. Les vésicules sont ensuite extraites de la membrane plasmique (endocytose) et regroupés avec la catégorie générale des vésicules au sein de la terminaison nerveuse, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils subissent une nouvelle exo-endocytose et du cycle (recyclage des vésicules). Ces processus ont été étudiés en utilisant une variété de techniques comme la microscopie électronique, les enregistrements électrophysiologiques, l&#39;ampérométrie et des mesures de capacitance. Surtout, au cours des deux dernières décennies un certain nombre de marqueurs marqués par fluorescence émergé, permettant de suivre les techniques optiques vésicules dans leur dynamique de recyclage. L&#39;un des marqueurs les plus couramment utilisés est le styryle ou FM colorant 1; structurellement, tous les colorants contiennent FM une tête hydrophile et une queue lipophile reliés par un anneau aromatique et une ou plusieurs doubles liaisons (Fig. 1B). Une expérience de teinture classique FM pour étiqueter un pool de vésicules consiste à baigner la préparation (fig. 1AI) avec le colorant lors de la stimulation du nerf (électriquement ou avec haute K +). Cela induit le recyclage des vésicules et le chargement ultérieur de la teinture dans des vésicules récemment endocytose (figure 1A I-III). Après le chargement des vésicules avec un colorant, un second tour de la stimulation dans un bain de teinture sans se déclencher la libération FM par exocytose (Fig. 1A IV-V), processus qui peut être suivie par une surveillance de la diminution d&#39;intensité de fluorescence (décoloration). Bien que les colorants FM ont grandement contribué au domaine de recyclage des vésicules, il n&#39;est pas possible de déterminer la localisation exacte ou la morphologie des vésicules individuels en utilisant la microscopie à fluorescence conventionnelle. Pour cette raison, nous expliquons ici comment FM colorants peuvent également être utilisés comme marqueurs de l&#39;endocytose utilisant la microscopie électronique, à travers photoconversion. La technique exploite la propriété photoconversion de colorants fluorescents pour générer des espèces réactives de l&#39;oxygène sous un éclairage intense. Les préparatifs marqués par fluorescence sont immergés dans une solution contenant diaminobenzidine (DAB) et illuminé. Espèces réactives générées par les molécules de colorant oxyder le DAB, qui forme une société stable, précipité insoluble qui a un aspect sombre et peuvent être facilement distingués en microscopie électronique 2,3. Comme DAB n&#39;est oxydé dans le voisinage immédiat de molécules fluorescentes (comme les espèces réactives de l&#39;oxygène sont de courte durée), la technique garantit que les structures ne sont marqués par fluorescence va contenir le précipité denses aux électrons. La technique permet donc l&#39;étude de l&#39;emplacement exact et la morphologie des activement le recyclage des organelles.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes at JoVE.com

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Colorants FM ont été d&#39;une aide précieuse dans la compréhension de la dynamique des synapses. FMS sont normalement suivies sous le microscope à fluorescence dans des conditions de stimulation différents. Toutefois, photoconversion de colorants FM combinée avec la microscopie électronique permet la visualisation des différents bassins des vésicules synaptiques, parmi les composants ultrastructure d&#39;autres, en boutons synaptiques.

Etudier Piscines vésicules synaptiques utilisant des colorants styryle photoconversion

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

studying-synaptic-vesicle-pools-using-photoconversion-of-styryl-dyes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K vues.  European Neuroscience Institute Göttingen. Colorants FM ont été d'une aide précieuse dans la compréhension de la dynamique des synapses. FMS sont normalement suivies sous le microscope à fluorescence dans des conditions de stimulation différents. Toutefois, photoconversion de colorants FM combinée avec la microscopie électronique permet la visualisation des différents bassins des vésicules synaptiques, parmi les composants ultrastructure d'autres, en boutons synaptiques.

Vidéo: Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Recherche

Neurosciences

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Diffusion latérale et l&#39;exocytose des protéines membranaires dans des neurones en culture évaluée à l&#39;aide de récupération de fluorescence et de fluorescence de perte de photoblanchiment

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

Examen de la vésicule synaptique recyclage utilisant des colorants FM Pendant évoqués, spontanée, et les activités synaptiques miniatures

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Issu l&#39;évolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Mesurer l’endocytose de la vésicule synaptique dans des neurones Hippocampal cultivés

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Culture In Vivo-comme les Astrocytes Murine en utilisant le protocole AWESAM rapide, Simple et peu coûteux

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

Modèle de souris de bois d’allumage induite par le pentylènetétrazole

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Alliant Optogenetics artificiel microARN pour caractériser les effets du gène Knockdown fonction présynaptique dans les Circuits de neurones intacts

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

Une analyse optique pour le recyclage de vésicule synaptique dans les neurones en culture surexprimant protéines présynaptiques

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de Patch-clamp de la cellule entière électrophysiologie

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...