Nous présentons une approche expérimentale précieuse pour étudier la cinétique de l’activation soudaine des neurones autonomes intrinsèques dans les cœurs perfusés et l’interaction entre l’activité catécholaminergique cardiaque et cholinergique. Les cœurs de souris perfusés peuvent être très sensibles aux changements de l’environnement, tels que la température, l’oxygénation et la concentration de perfusat. Ils nécessitent une surveillance plus étroite que les modèles d’animaux plus grands.
De plus, la micro-LED peut prendre quelques essais et erreurs au début pour obtenir des résultats cohérents. Nous travaillons à comprendre ce qui se passe dans le cœur lorsque les systèmes sympathique et parasympathique sont activés en même temps. Ce qui est nouveau, c’est que nous étudions ce sujet en utilisant l’optogénétique pour photostimuler les ganglions cardiaques et les neurones du cœur lui-même.
La micro-LED présentée ici est peu coûteuse et relativement simple à reproduire. En raison de sa taille, la micro LED est maniable et peut cibler des zones du cœur plus précisément que les sources lumineuses plus grandes. Pour commencer, sous un microscope de dissection dans un endroit bien ventilé, soudez les extrémités dénudées de deux fils de cuivre isolés aux points de contact d’une micro-LED de 465 nanomètres.
Connectez la micro-LED à une source d’alimentation et allumez-la pour tester la soudure. Coupez le centimètre inférieur d’une pointe de pipette filtrée de 200 microlitres. Poussez le filtre à l’aide d’une tige de petit diamètre.
Insérez la micro-LED avec les fils attachés dans la pointe de la pipette de manière à ce que la LED affleure l’extrémité de la pointe. Replacez le filtre en haut de la pointe de la pipette pour fixer la LED et les fils. Ensuite, supercollez les bords de la LED sur la pointe de la pipette.
Laissez sécher la superglue. Pour préparer l’élastomère de silicone, mélangez la base et l’agent de durcissement jusqu’à ce que la solution devienne uniforme. Retirez toutes les bulles du mélange à l’aide d’une chambre à vide.
Ensuite, prenez un tube à centrifuger de 0,5 millilitre et marquez les côtés pour faciliter le retrait des LED. Collez l’extérieur du tube de centrifugation pour éviter les fuites. Versez environ 0,2 millilitre d’élastomère de silicone dans le tube.
Placez l’embout de pipette micro-LED dans le tube, en veillant à ce qu’il y ait au moins un millimètre d’espace entre la LED et le bas du tube. Placez le tube de centrifugation micro-LED à la verticale dans un four à 50 degrés Celsius pendant huit heures ou toute la nuit. Une fois l’élastomère durci, retirez la LED du tube.
Une fois durci, coupez tout excès d’élastomère de la pointe de la LED avec un couteau utilitaire de précision en ne laissant pas plus d’un millimètre. Pour commencer, ajoutez 175 millilitres de solution Krebs-Henseleit ou KH au système de perfusion. Placez un filtre à membrane de 10 micromètres dans le système de perfusion Langendorff.
Ensuite, commencez la circulation. Allumez les bains-marie et réglez-les pour maintenir la température de perfusat à 37 degrés Celsius. Pour calibrer le débitmètre, arrêtez le débit dans le système de perfusion à l’aide d’un robinet d’arrêt.
Appuyez ensuite sur le bouton zéro du débitmètre pour effectuer l’étalonnage. Ouvrez le logiciel d’acquisition de données LabChart. Configurez le logiciel pour qu’il inclue 12 canaux.
Configurez des canaux pour la température du bain cardiaque, la température de perfusat aortique, les dérivations ECG un à trois pour les dérivations calculées supplémentaires, le calcul de la fréquence cardiaque, le débit et une sortie de générateur de fonctions pour suivre les impulsions LED. Ensuite, utilisez le canal désigné pour la fréquence cardiaque pour calculer la fréquence cardiaque. Activez la fonction de mesures cycliques, en la réglant pour détecter l’ECG de la souris sur la première dérivation.
Utilisez l’extension Cardiac Access de LabChart pour calculer les dérivations trois aVR, aVL et aVF en fonction des dérivations un et deux. Après avoir anesthésié et euthanasié la souris, tenez l’apophyse xiphoïde à l’aide d’une pince et coupez la cavité abdominale à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Coupez soigneusement le diaphragme pour ouvrir la cavité thoracique.
Coupez ensuite les côtes pour exposer le cœur et les poumons. Saisissez doucement les poumons et excisez le cœur et les poumons. Placez le cœur dans un plat contenant une solution de KH héparinisée.
Retirez les poumons et tous les gros dépôts de graisse. Sous un microscope à dissection, régler sur un grossissement de 2x. Transférez le cœur nettoyé dans une deuxième boîte de solution de KH héparinisée.
Localisez l’aorte et faites-la glisser sur la canule à l’aide d’une pince fine. Fixez le cœur à la canule avec une suture en soie 4-0. Ensuite, rincez la canule avec un bolus de KH hépariné pour éliminer le sang des vaisseaux coronaires.
Connectez le cœur canulé au système de perfusion et placez-le dans la boîte PDMS remplie de perfusat. Placez les électrodes de l’aiguille ECG dans la boîte PDMS selon le triangle d’Einthoven. Faites pivoter le cœur de manière à ce que l’oreillette gauche soit accessible.
Utilisez des micro-ciseaux à ouverture automatique pour créer une incision d’un millimètre dans l’oreillette gauche. Insérez un tube d’un millimètre de diamètre dans l’incision pour permettre au perfusat piégé dans le ventricule gauche de s’écouler. Ensuite, faites pivoter le cœur de manière à ce que l’oreillette droite soit tournée vers le haut et que le nœud sino-auriculaire soit accessible pour l’éclairage.
Ajustez les électrodes ECG au besoin en les rapprochant du cœur pour améliorer le rapport signal/bruit. Pour l’activation optogénétique, connectez le dispositif micro-LED à un générateur de fonctions et configurez-le pour produire des ondes d’impulsion d’une fréquence de 10 hertz, d’une largeur d’impulsion de 30 millisecondes et d’une amplitude de 10 volts crête à crête. Placez délicatement la micro-LED sur le nœud sino-auriculaire.
Allumez ensuite le générateur de fonctions et observez les changements de fréquence cardiaque dus à la photostimulation. Les changements immédiats de la fréquence cardiaque indiquent une activation efficace. Éteignez le générateur de fonctions.
Laissez la fréquence cardiaque revenir aux niveaux d’avant l’activation. Si l’activation optogénétique entraîne un changement de fréquence cardiaque inférieur à 100 BPM, repositionnez la micro-LED pour éclairer les neurones de l’oreillette droite. La stimulation optogénétique des neurones ChAT a réduit la fréquence cardiaque de plus de 100 BPM pendant la stimulation lumineuse sans que la noradrénaline ne maintienne la réduction tout au long de la stimulation.
Avec 2 000 nanomoles de noradrénaline, la fréquence cardiaque a chuté de 40 BPM et a commencé à récupérer avant que la lumière ne s’éteigne. La suppression optogénétique de la fréquence cardiaque par photostimulation neuronale ChAT a été moins efficace pour surmonter les augmentations de la fréquence cardiaque induites par des doses élevées de noradrénaline, ce qui a entraîné des temps de suppression plus courts et des diminutions plus faibles de la fréquence cardiaque.
