La plupart des problèmes de santé peuvent être mieux pris en charge s’ils sont détectés tôt. Les biomarqueurs disponibles dans les fluides corporels accessibles sont les moyens les plus prometteurs pour la détection précoce des problèmes de santé. Nous rapportons des améliorations dans les méthodes d’étude des biomarqueurs de microARN libérés par de petites vésicules extracellulaires du cerveau humain.
Cette méthode nous a permis d’identifier la variation des petites cargaisons vésicales extracellulaires entre différents sous-types génétiques de maladies, telles que la démence, d’identifier des candidats biomarqueurs de cargaison qui pourraient être détectés dans les fluides périphériques et d’améliorer le diagnostic précoce de la maladie. Ainsi, ce protocole équilibre l’efficacité, l’accessibilité et la pureté du produit, ce qui le rend facilement reproductible dans différents environnements de laboratoire. Il ne nécessite aucun équipement spécialisé et les colonnes préemballées assurent la cohérence.
Par conséquent, tous les résultats de biomarqueurs seront facilement traduits en un résultat clinique souhaité. Avec l’approbation de nouveaux médicaments modificateurs de la maladie, le diagnostic doit prendre ces maladies beaucoup plus tôt qu’il n’est actuellement possible de le faire afin de maximiser les avantages pour le patient. De telles méthodes permettront d’identifier de nouveaux biomarqueurs de microARN pertinents pour la maladie, ce qui peut entraîner une meilleure gestion de la santé à l’aide d’options de traitement et de soins spécifiques.
Nous utiliserons nos capacités existantes pour développer des méthodes d’identification de marqueurs spécifiques aux tissus et aux types cellulaires capables de détecter les biomarqueurs de microARN libérés à partir d’un type de cellule spécifique au sein d’un mélange hétérogène présent dans les fluides corporels. Pour commencer, coupez finement 250 milligrammes de tissu cérébral congelé à l’aide d’un scalpel stérilisé sur une plaque froide. Ajouter deux millilitres de 75 unités par millilitre de collagénase de type III dans une solution d’hibernation sur le tissu.
Placez chaque échantillon dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Au bout de cinq minutes, retournez l’échantillon deux fois pour le mélanger. Au bout de 10 minutes, pipeter doucement l’échantillon trois fois à l’aide d’une bande jetable en plastique de 10 millilitres.
Ensuite, placez chaque échantillon sur de la glace et ajoutez un cocktail d’inhibiteurs de protéase et un inhibiteur de phosphatase à chaque échantillon. Centrifugez chaque échantillon de tissu cérébral à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant.
Et puis le centrifuger à 2000G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Maintenant, récupérez le surnageant et filtrez-le à travers un filtre de 0,22 micromètre. Ensuite, centrifugez le filtrat à 10 000 G pendant 48 minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir recueilli le surnageant, ajoutez un tampon de précipitation à chaque échantillon dans un rapport de deux pour un. Et incubez l’échantillon pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez chaque échantillon à 10 000 G pendant 96 minutes à quatre degrés Celsius.
Et remettre en suspension la pastille dans 100 microlitres de PBS sans vésicule extracellulaire. Équilibrez la colonne de chromatographie d’exclusion stérique ou SEC à température ambiante pendant 15 minutes. Après l’équilibrage, retirez le tampon de conservation du haut de la colonne et lavez la colonne deux fois avec 250 microlitres de PBS sans vésicules extracellulaires.
Ajoutez ensuite la pastille remise en suspension dans la colonne et centrifugez à 50G pendant 30 secondes. Après avoir jeté le flux, ajoutez 180 microlitres de PBS sans VE et centrifugez la colonne à 50G pendant une minute pour permettre aux petites vésicules extracellulaires dérivées du cerveau d’éluer. Pour époux les petites vésicules extracellulaires, diluez l’échantillon isolé de petites vésicules extracellulaires dans un rapport égal avec le tampon de lyse et d’extraction.
Agitez l’échantillon dilué à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 14 000 G pendant 15 minutes. Prélever le surnageant protéique et mesurer les concentrations de protéines à l’aide d’un kit de dosage des protéines.
Pour effectuer une analyse de suivi des nanoparticules, diluez chaque échantillon dans du PBS en utilisant un facteur de dilution de 1 à 1000. Injectez l’échantillon dans l’instrument NTA. Et réglez l’instrument pour lire l’échantillon à une longueur d’onde de 550 nanomètres.
Utilisez la quantité de particules pour mesurer la quantité de protéines par particule exprimée en femtogrammes conformément aux directives MISEV. Ensuite, diluez le colorant orange ou CMO du masque cellulaire dans du PBS par un facteur de dilution de 1 à 1000. Diluez ensuite le colorant CMO avec l’échantillon de petite vésicule extracellulaire en utilisant un facteur de dilution de 1 à 10.
Et incubez le mélange dans l’obscurité pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Maintenant, diluez davantage le mélange de petites vésicules extracellulaires de colorant CMO en utilisant du PBS à un facteur de dilution de 1 à 1000. À l’aide de l’instrument NTA, lisez le colorant CMO de chaque petit échantillon de vésicule extracellulaire à une longueur d’onde de 550 nanomètres.
Pour le suivi des anticorps fluorescents, diluez chaque tétraspan et anticorps fluorescent dans le PBS en utilisant un facteur de dilution de 1 à 10. Diluez ensuite chaque colorant d’anticorps avec l’échantillon de petite vésicule extracellulaire en utilisant un facteur de dilution de 1 à 10. Et incubez le mélange dans l’obscurité pendant deux heures à quatre degrés Celsius.
Ensuite, diluez le deuxième mélange d’anticorps à l’aide de PBS avec un facteur de dilution de 1 à 1000. Lisez les signaux d’anticorps fluorescents de la petite vésicule extracellulaire à une longueur d’onde de 550 nanomètres à l’aide de l’instrument NTA. L’analyse par transfert Western a confirmé la présence des marqueurs positifs CD9, CD63, CD81, Flotilla One et TSG101 dans les petites vésicules extracellulaires dérivées du cerveau, tandis que la calnexine était absente, ce qui indique l’absence de contamination cellulaire.
L’analyse du suivi des nanoparticules a révélé que les particules isolées avaient une taille comprise entre 50 et 200 nanomètres, avec une concentration maximale d’environ 100 nanomètres. Les données de coloration CMO ont montré que 52,35 % des particules ont une bicouche lipidique, dont 34,66 % contenaient du CD9, 15,49 % contenaient du CD63 et 12,01 % contenaient du CD81.
