Nous tenons à souligner l&#39;esprit de coopération de tous les membres du laboratoire Caldwell. Un Basil O&#39;Connor Scholar Award de la Mars of Dimes et une bourse de carrière de la National Science Foundation pour GAC, ainsi que d&#39;une subvention de recherche de premier cycle Programme scientifique de l&#39;Institut médical Howard Hughes à l&#39;Université d&#39;Alabama, ont financé l&#39;excitabilité neuronale et recherche sur l&#39;épilepsie dans le laboratoire de M. Caldwell.

Paradigme exposition à l&#39;aldicarbe <ol><li> Le premier jour, s&#39;assurer que, au moins trente jeunes vers le stade adulte de chaque génotype et de chaque répétition sera disponible pour des essais de l&#39;aldicarbe sur la deuxième journée. Il est préférable si un expérimentateur sélectionne une cinquantaine ou plus vers l&#39;étape L4 sur des plaques NGM frais (mieux sans nystatine), qui contiennent E. coli (de préférence OP50) comme source de nourriture, et les cultiver pendant 12-24 heures à une température constante et permissive (20 ° C à 22 ° C est préférable, bien que 25 ° C est correct). </li><li> Le deuxième jour, faire une solution 100 mM d&#39;aldicarbe à l&#39;éthanol 70% (EtOH) et 30% ddH 2 O. Passez le montant approprié de l&#39;aldicarbe sur des plaques NGM moins nystatine avec des volumes définis pour atteindre les concentrations d&#39;aldicarbe désiré. Nous avons constamment utiliser 0,5 mM aldicarbe par plaquage 37,5 uL de 100 mm sur 7,5 aldicarbe plaques NGM ml. Laisser les plaques aldicarbe à sécher pendant environ 30-60 minutes à température ambiante. Il n&#39;est pas nécessaire de casser le couvercle. Alternativement, l&#39;aldicarbe peut être ajouté à NGM et conservés à 4 ° C pendant une semaine. &nbsp;</li><li> Après le séchage des volumes, assiette uniforme de E. coli (de préférence OP50) sur le centre de chaque assiette aldicarbe et sec pour un autre 30-60 minutes à température ambiante. Nous avons constamment plaque 25 uL d&#39;OP50, ce qui crée une pelouse alimentaires de taille suffisante pour maintenir les vers concentrée dans un petit coin sans surpeuplement. &nbsp;</li><li> Lorsque la pelouse est sèche la nourriture, on peut procéder à des dosages aldicarbe. En raison de la nature subjective des dosages aldicarbe, il est fortement recommandé que les expériences soient effectuées &quot;aveuglément&quot;. Un collègue de l&#39;expérimentateur primaire pourrait ré-étiqueter les plaques originales avec des vers à doser. De même, le collègue pourrait transférer vers des plaques originales sur des plaques de aldicarbe crypté immédiatement avant le démarrage d&#39;une minuterie. Si l&#39;expérimentateur anticipe titrant une souche particulière de virus avec un phénotype caractéristique, comme manque de coordination, alors il faut aussi un contrôle avec un phénotype similaire à réduire les préjugés. Par ailleurs, il est préférable si l&#39;expérimentateur dosages d&#39;une souche de type sauvage, ainsi que d&#39;une souche résistante et une souche hypersensible, en parallèle pour aider à normaliser les expériences. L&#39;expérimentateur doit s&#39;efforcer d&#39;analyser un nombre constant de vers pour chaque réplique. Nous avons constamment analyser les vers de thirty un génotype unique pour chaque répétition. Nous avons également effectuer au moins trois répétitions pour chaque expérience. Un expérimentateur expérimenté devrait être capable d&#39;analyser au moins six souches à la fois. &nbsp;</li><li> Comptez le nombre de vers paralysé par aiguillon d&#39;une manière cohérente chaque ver avec un fil de platine. Nous avons constamment prod nos vers à deux reprises sur la tête et deux sur la queue toutes les 30 minutes pour un total de trois heures. Cessation de pompage du pharynx peut également être utilisé pour définir la paralysie, mais seulement si l&#39;expérimentateur emploie une définition cohérente de paralysie sur tous les dosages. Aussi, il est intéressant de noter que certains vers, en particulier ceux qui sont résistants à l&#39;aldicarbe, peut tenter de ramper hors de la plaque. Dans ce cas, l&#39;expérimentateur peut répandre une quantité constante de l&#39;acide palmitique, une barrière physique à la locomotion ver, autour des plaques aldicarbe. Nous répandons 25 ul de 10 mg d&#39;acide palmitique / ml EtOH. </li></ol> Paradigme de l&#39;exposition PTZ <ol><li> Le premier jour, s&#39;assurer que, au moins trente jeunes vers le stade adulte de chaque génotype et de chaque répétition sera disponible pour des essais de PTZ, le deuxième jour. Il est préférable si un expérimentateur sélectionne une cinquantaine ou plus vers l&#39;étape L4 sur des plaques NGM frais (mieux sans nystatine), qui contiennent E. coli (de préférence OP50) comme source de nourriture, et les cultiver pendant 12-24 heures à une température constante et permissive (20 ° C à 22 ° C est préférable, bien que 25 ° C est correct). </li><li> Le deuxième jour, faire un PTZ 0,5 g / ml solution stock ddH 2 O du PTZ. Étendre la quantité appropriée de PTZ sur NGM minus plaques nystatine avec des volumes définis pour atteindre les concentrations PTZ désiré. Parce que nous préférons dose-réponse des dosages pour PTZ, nous plateau des quantités variables de PTZ sur 7,5 ml plaques NGM. Par exemple, on peut la plaque 37,5 ul de la solution stock PTZ sur une plaque 7,5 ml NGM pour faire un 5 mg PTZ / ml solution. Laisser les plaques PTZ à sécher pendant environ 60-120 minutes à température ambiante. Il n&#39;est pas nécessaire de casser le couvercle. Alternativement, le PTZ peut être ajouté directement à NGM, mais il devrait être immédiatement utilisé pour les essais après solidification. La stabilité du PTZ est considérablement inférieure à celle de l&#39;aldicarbe. Par conséquent, les essais avec des plaques PTZ âgées sont moins fiables. PTZ doit être conservé à -20 ° C dans un dessicateur avec un agent de séchage avant utilisation. Nous préférons jeter PTZ environ deux mois après l&#39;ouverture pour assurer la stabilité. </li><li> Après le séchage des volumes, assiette uniforme de E. coli (de préférence OP50)sur le centre de chaque assiette PTZ et sec pour un autre 30-60 minutes à température ambiante. Nous avons constamment plaque 25 uL d&#39;OP50, ce qui crée une pelouse alimentaires de taille suffisante pour maintenir les vers concentrée dans un petit coin sans surpeuplement. &nbsp;</li><li> Lorsque la pelouse est sèche la nourriture, on peut procéder à des dosages PTZ. Bien que des dosages PTZ sont moins subjectifs que des dosages aldicarbe, il est toujours fortement recommandé que les expériences soient effectuées &quot;aveuglément&quot;. Un collègue de l&#39;expérimentateur primaire pourrait ré-étiqueter les plaques originales avec des vers à doser. De même, le collègue pourrait transférer vers des plaques originales sur des plaques de PTZ crypté immédiatement avant le démarrage d&#39;une minuterie. Si l&#39;expérimentateur anticipe titrant une souche particulière de virus avec un phénotype caractéristique, comme manque de coordination, alors il faut aussi un contrôle avec un phénotype similaire à réduire les préjugés. Par ailleurs, il est préférable si l&#39;expérimentateur dosages d&#39;une souche de type sauvage, ainsi que les souches ayant antérieure ou du corps entier des convulsions, en parallèle pour aider à normaliser les expériences. L&#39;expérimentateur doit s&#39;efforcer d&#39;analyser un nombre constant de vers pour chaque réplique. Nous avons constamment analyser les vers de thirty un génotype unique pour chaque répétition. Nous avons également effectuer au moins trois répétitions pour chaque expérience. Un expérimentateur expérimenté devrait être capable d&#39;analyser au moins trois souches à la fois. Pourtant, la fréquence et l&#39;intensité du PTZ convulsions provoquées par habitude pic entre 15-30 minutes d&#39;exposition, puis atténuer les vers deviennent paralysés ou, dans certains cas, s&#39;acclimater à la drogue. </li><li> Comptez le nombre de &quot;épileptique comme« convulsions vers toutes les 30 minutes pour un total d&#39;une heure. Il est préférable de marquer le nombre de vers avec des convulsions antérieures, que nous appelons «la tête-bobs», séparément du nombre de vers avec tout le corps des convulsions, une paralysie complète du corps, que nous appelons «tonique», ou une combinaison des convulsions antérieures à la paralysie BWM, que nous appelons «tonico-cloniques». La plupart des vers d&#39;un seul génotype exposer un seul type de convulsion. Toutefois, tonico-cloniques des vers souvent devenus complètement tonique, si on doit continuer le test des 30 dernières minutes, même si tous les vers ont déjà montré des convulsions. Aussi, il est intéressant de noter que certains vers peuvent tenter de ramper hors de la plaque. Dans ce cas, l&#39;expérimentateur peut répandre une quantité constante de l&#39;acide palmitique autour des plaques PTZ. Nous répandons 25 ul de 10 mg d&#39;acide palmitique / ml EtOH. </li></ol> Réponses comportementales de certains mutants de C. elegans transmission synaptique à l&#39;aldicarbe et PTZ <table style="height: 157px;" border="1"><tbody><tr><th> Nom Mutant </th><th> Rôle Synaptic </th><th> Comportement sans drogue </th><th> Réponse comportementale à l&#39;aldicarbe (comparé au type sauvage N2) </th><th> Réponse comportementale au PTZ </th></tr><tr><td> Tom-1 (ok188) </td><td> inhibe la transmission synaptique </td><td> non coordonnés </td><td> taux bonifié de la paralysie </td><td> indiscernable de type sauvage </td></tr><tr><td> unc-43 (n498n1186) </td><td> complexes </td><td> non coordonnés </td><td> taux bonifié de la paralysie </td><td> du corps entier des convulsions </td></tr><tr><td> unc-25 (E156) </td><td> favorise la transmission du GABA </td><td> non coordonnés </td><td> taux bonifié de la paralysie </td><td> convulsions antérieures, une paralysie complète du corps </td></tr><tr><td> SNB-1 (md247) </td><td> favorise la transmission synaptique </td><td> non coordonnés </td><td> taux réduit de la paralysie </td><td> convulsions antérieures </td></tr><tr><td> unc-4 (E120) </td><td> favorise la transmission d&#39;ACh </td><td> non coordonnés </td><td> taux réduit de la paralysie </td><td> indiscernable de type sauvage </td></tr></tbody></table> Deux stimulants de neurones, un inhibiteur de l&#39;acétylcholinestérase, appelé aldicarbe, et un antagoniste des récepteurs GABA, appelé pentylènetétrazole (PTZ), peuvent être utilisées de manière complémentaire à caractériser C. elegans mutants transmission synaptique. L&#39;excès d&#39;acétylcholine excitateurs (ACh) s&#39;accumule au ver corps mur de jonctions neuromusculaires (NMJs) de mutations délétères dans les régulateurs négatifs de l&#39;ACh transmission (par exemple tam-1 et unc-43) ou des régulateurs positifs de la transmission inhibitrice GABA (par exemple, unc-25). Inversement, les niveaux de l&#39;acétylcholine au excitateurs NMJs ver sont diminués par des mutations délétères dans les régulateurs positifs de la transmission synaptique général (par exemple, SNB-1) ou des gènes de transmission ACh spécifiques (par exemple unc-4). Lorsqu&#39;on les compare à des vers N2 de type sauvage, vers mutants présentant un taux élevé d&#39;ACh transmission excitatrice au NMJs présentent des taux majorés d&#39;aldicarbe-induite paralysie, tandis que les vers mutants avec des abaissé ACh transmission excitatrice montrent des taux réduits de l&#39;aldicarbe induite paralysie. Bien PTZ perturbe synchronie neuronale au muscles C. elegans paroi du corps, n&#39;est pas sans rappeler l&#39;aldicarbe, PTZ antagonise aussi inhibiteur GABA au muscles C. elegans la tête. En conséquence, la sensibilité aldicarbe peut pas prédire avec précision la sensibilité PTZ. Vers mutants avec des défauts spécifiques au règl négatif ou positiftion de la transmission d&#39;ACh sont indiscernables des vers N2 de type sauvage en présence du PTZ, tandis que vers mutants avec des défauts dans la régulation positive de la transmission synaptique général ou des défauts spécifiques à la pièce de transmission inhibiteur GABA robustes PTZ convulsions provoquées antérieure. Par ailleurs, unc-43 de perte de fonction de mutants d&#39;affichage complet du corps des convulsions en présence du PTZ et probablement d&#39;autres anomalies de la transmission synaptique, qui contribuent à leurs réponses médicament unique.

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

Les protocoles actuels d&#39;exposition à l&#39;aldicarbe avec C. elegans ne permettent pas de distinguer entre les expérimentateurs mutants avec des déficits spécifiques dans la transmission de l&#39;acétylcholine et des mutants avec des déficits généralisés dans la transmission synaptique, comme les deux classes de mutants présentent une résistance à l&#39;aldicarbe. De même, l&#39;aldicarbe ne peut pas être utilisé pour déterminer si les mutants ont des déficits spécifiques dans la transmission du GABA ou les d...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Aldicarb</td>
<td>Reagent</td>
<td>Supelco, Inc.</td>
<td>PS734</td>
<td>Purchasable from Sigma</td>
</tr>
<tr>
<td>Pentylenetetrazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

Le nématode Caenorhabditis elegans, est devenu un modèle utile pour étudier la neurotransmission. C. elegans est unique parmi les modèles animaux, que l&#39;anatomie et la connectivité de son système nerveux a été déterminée à partir de micrographies électroniques et affiné par des dosages pharmacologiques. Dans cette vidéo, nous décrivons comment deux complémentaires stimulants de neurones, un inhibiteur de l&#39;acétylcholinestérase, appelé aldicarbe, et un acide gamma-aminobutyrique (GABA) antagoniste des récepteurs, appelés pentylènetétrazole (PTZ), peuvent être employées pour caractériser spécifiquement signalisation à C. elegans jonctions neuromusculaires (NMJs) et de faciliter notre compréhension des antagonistes circuits neuronaux. De 302 neurones de C. elegans, dix-neuf GABAergiques de type D neurones moteurs innervant muscles de la paroi du corps (BWMs), tandis que quatre neurones GABAergiques, appelé RME, muscles de la tête innervent. Inversement, les neurones moteurs 39 exprimer le neurotransmetteur excitateur, l&#39;acétylcholine (ACh), et la transmission antagonistes GABA à BWMs pour coordonner la locomotion. La nature antagoniste des neurones moteurs GABAergiques et cholinergiques au NMJs paroi du corps a été initialement déterminé par ablation laser et par la suite renforcée par exposition à l&#39;aldicarbe. Aiguë des résultats d&#39;exposition aldicarbe dans une paralysie du temps de cours ou la dose de réactif vers de type sauvage. Pourtant, la perte de l&#39;ACh transmission excitatrice confère une résistance à l&#39;aldicarbe, comme moins ACh s&#39;accumule au NMJs ver, menant à moins de stimulation du BWMs. Résistance à l&#39;aldicarbe peut être observé avec l&#39;ACh spécifiques ou générales mutants fonction synaptique. Conformément aux antagonistes GABA et l&#39;acétylcholine de transmission, la perte de transmission du GABA, ou une incapacité à réguler négativement la libération d&#39;acétylcholine, confère une hypersensibilité à l&#39;aldicarbe. Bien que l&#39;exposition aldicarbe a conduit à l&#39;isolement d&#39;homologues de gènes de nombreuses ver neurotransmission, exposition à l&#39;aldicarbe seul ne peut pas déterminer efficacement les rôles qui prévaut pour les gènes et les voies de neurones spécifiques de C. elegans moteur. À cette fin, nous avons introduit une approche complémentaire expérimentale, qui utilise PTZ. Mutants neurotransmission affichage phénotypes claire, distincte de l&#39;aldicarbe induite paralysie, en réponse à PTZ. Vers de type sauvage, ainsi que des mutants avec des incapacités spécifiques à la libération d&#39;ACh ou de recevoir, ne montrent pas de sensibilité apparente à PTZ. Toutefois, les mutants de GABA, ainsi que les mutants en général la fonction synaptique, l&#39;affichage des convulsions antérieures dans des délais de cours ou de dose-réactive. Mutants qui ne peuvent pas réguler négativement la libération de neurotransmetteurs générale et, par conséquent, sécrètent des quantités excessives d&#39;ACh sur BWMs, devenu paralysé PTZ. Les phénotypes PTZ-induite des classes de mutants discrets indiquent qu&#39;une approche complémentaire avec l&#39;aldicarbe et de paradigmes d&#39;exposition PTZ chez C. elegans peut accélérer notre compréhension de la neurotransmission. Par ailleurs, les vidéos démontrant comment nous effectuons des tests pharmacologiques devraient établir des méthodes cohérentes pour la recherche de C. elegans.

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Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Cette vidéo montre comment employer deux stimulants de neurones, aldicarbe et pentylènetétrazole (PTZ), de façon complémentaire pour étudier la fonction synaptique dans le nématode C. elegans. Cette approche complémentaire peut également être utilisé pour faire la lumière sur les mécanismes de l&#39;évolution, conservée pour synchronie neuronale modulant et a des implications pour l&#39;épilepsie et des convulsions.

Paradigmes pour la caractérisation pharmacologique de C. elegans mutants transmission synaptique

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.1K vues.  University of Alabama. Cette vidéo montre comment employer deux stimulants de neurones, aldicarbe et pentylènetétrazole (PTZ), de façon complémentaire pour étudier la fonction synaptique dans le nématode C. elegans. Cette approche complémentaire peut également être utilisé pour faire la lumière sur les mécanismes de l'évolution, conservée pour synchronie neuronale modulant et a des implications pour l'épilepsie et des convulsions.

Vidéo: Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Recherche

Biologie

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Les dosages des Saisies en Neurocircuit Mutants épilepsie du Drosophile</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un procédé de culture embryonnaire<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellules

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Méthodes pour Blessant Peau et Essais pour les réponses de blessure dans<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...