Ce protocole permet aux chercheurs d’observer comment les C-elgans répondent à l’agoniste des récepteurs de l’acétylcholine Levamisole. Une sensibilité altérée au lévamisole peut suggérer des défauts de signalisation à leur jonction neuromusculaire ou à leur fonction musculaire. Un avantage majeur est que la nage vigoureuse des C-elgans dans la solution Levamisole permet aux chercheurs de quantifier la paralysie dépendante du temps de centaines de vers en seulement une heure.
Compter le nombre de vers dans chaque puits toutes les cinq minutes peut être accablant. Le nombre de puits analysés ou les points temporels peuvent être ajustés si nécessaire. Pour commencer, préparez le milieu de croissance des nématodes en combinant trois grammes de chlorure de sodium, 2,5 grammes de pep tone et 17 grammes de gélose avec un litre d’eau désionisée dans une fiole munie d’une barre d’agitation.
Après l’autoclavage, placez le média sur une plaque chauffante réglée à 70 degrés Celsius et remuez à une vitesse modérée pendant une heure. Ajouter un millilitre de cinq milligrammes par millilitre de cholestérol goutte à goutte pour éviter les précipitations. Un millilitre d’une molaire de chlorure de calcium, un millilitre d’une molaire de sulfate de magnésium et 25 millilitres d’une molaire de phosphate de potassium de pH 6,0 tampon dans le milieu.
Transférer deux millilitres de milieu de croissance des nématodes dans chaque puits d’une plaque de 24 puits à l’aide d’une pipette sérologique stérile. Laissez les assiettes sécher sur le banc pendant deux jours avant de s’asseoir avec des bactéries. Choisissez une seule colonie op 50 dans un bouillon B et réglez la culture à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
À l’aide d’une pipette stérile, déposer 30 microlitres de suspension OP50 sur la gélose au milieu de chaque puits. Laissez les assiettes reposer à température ambiante pendant au moins deux jours après l’assise pour permettre à une pelouse bactérienne de se former. Cultiver des c-63 Lev10 et unc-49 C-elgan de type sauvage jusqu’à l’âge adulte sur des plaques de six centimètres, en préparant au moins huit plaques par souche.
Préparer la solution de blanchiment sous le capot le jour de la synchronisation. Mélanger 10 millilitres d’eau de Javel, 2,5 millilitres d’hydroxyde de sodium et 37,5 millilitres d’eau désionisée dans un tube chronique de 50 millilitres. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, lavez les vers adultes gravides d’au moins quatre plaques avec un tampon M9 et transférez-les dans un tube chronique de 15 millilitres.
Faites tourner ces 716 G pendant une minute à température ambiante, puis retirez le super nageant à l’aide d’une pipette de transfert. Ajouter 10 millilitres de la solution de blanchiment. Secouez doucement le tube pendant quatre minutes jusqu’à ce que la plupart des carcasses de vers, mais pas toutes, se soient dissoutes.
Faites tourner à 716 G pendant une minute. Versez la solution d’eau de Javel en un seul mouvement. Tant que le tube n’est pas secoué à ce stade, les œufs colleront sur le côté du tube à 15 millilitres de tampon M9 et inverseront.
Tournez à 716 G pendant une minute et versez la mémoire tampon M9 en un seul mouvement fluide. Répétez ce lavage avec une solution tampon trois fois. Après le lavage final, ajoutez 10 millilitres de M9 frais et placez-le sur un rotateur pendant la nuit à 15 degrés Celsius pour isoler une population synchronisée d’animaux affamés au stade larvaire.
Imprimez sur une plaque de 24 puits et attribuez des souches à des endroits aléatoires. Environ 24 heures après la préparation de l’eau de Javel, faire tourner les vers L1 affamés éclos à 716 G pendant une minute à température ambiante. Retirez environ neuf millilitres de tampon M9 à l’aide d’une pipette de transfert en plastique, puis mélangez délicatement les premiers vers larvaires affamés dans le tampon M9 restant.
Pipeter immédiatement trois microlitres de vers et un tampon M9 sur une lame de microscope et déterminer le nombre de L1. Le nombre souhaité est de 20 à 30 L1 dans trois microlitres. Pipeter trois microlitres de L1 dans chaque puits selon la carte de plaque préfabriquée, laissez les vers grandir jusqu’à l’âge adulte pendant trois jours à 20 degrés Celsius.
Imprimez la feuille de données vierge qui sera utilisée pour enregistrer le nombre de vers se déplaçant dans chaque puits toutes les cinq minutes pendant une heure. Vérifiez les vers dans les plaques de 24 puits. À l’aide d’un marqueur, placez un X sur le couvercle de la plaque au-dessus de tous les puits contaminés, affamés ou trop de vers, ce qui rendra le comptage difficile.
Faire 0,4 millimolaire solution de lévamisole en ajoutant 200 microlitres de 100 millimolaires de lévamisole à 50 millilitres de M9. Démarrez une minuterie, puis à l’aide d’une pipette de transfert, ajoutez un millilitre de 0,4 millimolaire de lévamisole aux deux premiers puits, de sorte que les animaux nagent librement. Continuer à ajouter du lévamisole aux puits adjacents, en échelonnant le temps en fonction du nombre de puits à analyser. À cinq minutes, commencez à compter manuellement uniquement le nombre de vers en mouvement dans chaque puits, en commençant par le premier puits, et notez ce nombre sur la feuille de données.
Continuez à compter le nombre de vers en mouvement dans chaque puits toutes les cinq minutes pendant une heure. À la fin de l’essai ou lorsque le temps le permet, notez le nombre total de vers dans chaque puits. Obtenez la plaque, la carte et notez quelle souche correspond à chaque puits.
Entrez les données dans une feuille de calcul en commençant par le nombre total de vers dans chaque puits et en les organisant par génotype. En combinant les données des puits, déterminez le nombre de vers se déplaçant à chaque point temporel. Utilisez cette option pour calculer le nombre de paralysants à chaque point temporel.
Créez un tableau de données de sorte que la colonne de gauche indique l’heure et que les colonnes suivantes contiennent les données pour chaque souche. Pour chaque animal paralysé dans les cinq premières minutes, créez une rangée et entrez-en une pendant cinq minutes. Répétez cette opération pour chaque point temporel.
Pour tous les animaux qui ne paralysent pas à la fin de l’essai, entrez un zéro pendant 60 minutes. Utilisez ces données pour créer une courbe de survie dans le logiciel statistique spécifique utilisé ici pour afficher visuellement la paralysie dépendante du temps de la population. Les données relatives à toutes les souches analysées doivent être saisies dans le même tableau de données, en laissant les espaces nécessaires.
Des mutations dans les sous-unités du récepteur de l’acétylcholine lévamisolaire, ainsi que dans les gènes nécessaires au regroupement des récepteurs de l’acétylcholine sensibles au lévamisole post-synaptiques, provoquent une résistance à la paralysie induite par le lévamisole observée chez les mutants unc-63 et Lev-10 respectivement. La perte du canal ionique GABA-dépendant unc-49 a provoqué une hypersensibilité au lévamisole en raison de la perturbation de l’équilibre approprié de la signalisation cholinergique et GABAergique. Une bonne préparation de 24 plaques de puits est essentielle.
Si les pelouses bactériennes ne sont pas sèches avant de repérer les L1, la solution de lévamisole peut devenir trouble pendant le test, ce qui inhibe l’observation. En modifiant les plaques de 24 puits, ce protocole peut être réalisé avec des animaux ARNi abattus. Cela permet aux chercheurs d’étudier les gènes de C-elgan, pour lesquels les mutants ne sont pas disponibles.
