L’objectif global de cette procédure est de démontrer la paralysie induite par la natation ou SWIP, un essai comportemental pour évaluer la signalisation de dopamine dans C.elegans. Swip permet l’identification rapide des gènes à l’intérieur ou liés à la synapse dopaminergique. Cette méthode permet d’examiner les effets produits par un excès de dopamine extracellulaire qui est causé par exemple par des médicaments ou par des mutations chez le transporteur de dopamine.
Pour s’assurer que tous les vers testés pendant l’essai nagent pendant le même laps de temps, les animaux doivent être transférés rapidement dans la solution. Sirisha Kudumala et Serene Sossi feront la démonstration de la procédure. Ils travaillent tous les deux dans mon laboratoire.
Pour mettre en place des cultures de démarrage de vers, utilisez une spatule stérile pour couper de petits morceaux d’agar d’une plaque contenant des C.elegans bien nourris et transférer les morceaux d’agar dans des plaques individuelles de NA22 E.coli. Après avoir couvé les plaques à 20 degrés Celsius pendant trois à quatre jours, confirmez visuellement la présence d’adultes gravid sous un microscope stéréo. Pour obtenir une population synchronisée de vers, gicler de l’eau sur une plaque pleine d’adultes gravid.
Faites pivoter doucement la plaque pour déloger les vers et utilisez une pipette d’élimination pour transférer les vers dans un tube conique en polystyrène de 15 millilitres. Après avoir tiré les vers d’une deuxième plaque dans le tube, recueillir les vers par centrifugation pour trois lavages en 15 millilitres d’eau autoclavée par lavage. L’eau doit apparaître claire après le dernier lavage.
Après la dernière centrifugation, ajouter cinq millilitres d’une solution d’hydroxyde de sodium hypochlorure de sodium fraîchement préparée aux vers et mélanger rapidement avec un vortex. Incuber le tube sur un rocker, placer une goutte de solution de ver sur une lame de microscope en verre et vérifier la lyse de ver sous un stéréoscope toutes les deux minutes pendant quatre à huit minutes. Lorsqu’environ 70 % des vers ont été lysés et que les œufs ont été relâchés, arrêtez immédiatement la lyse avec l’ajout d’un tampon pour les œufs.
Ensuite, centrifugez les embryons et les carcasses de vers quatre fois en résusant la pastille avec tampon d’oeufs frais entre les lavages pour enlever tout l’eau de Javel restante. Après le dernier lavage, la pastille doit apparaître blanche. Resuspendez la pastille en cinq millilitres d’eau autoclavée et cinq millilitres de saccharose à 60 % pour séparer les embryons des carcasses par centrifugation.
Retirez soigneusement le tube de la centrifugeuse après la séparation du gradient de densité et utilisez une pipette pasteur en verre pour transférer de trois à quatre millilitres des embryons flottant au ménisque supérieur dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Lavez les embryons trois fois avec de l’eau autoclavée pour enlever le saccharose suivi de trois lavages dans le tampon M9. Après le dernier lavage, incuber les embryons sur un shaker pendant la nuit dans 10 millilitres de tampon M9 frais pour permettre aux œufs d’éclore et de rester au stade larvaire L1.
Après pas plus de 14 heures sur le shaker, lavez les larves de L1 trois fois avec l’eau autoclavée pour enlever les phéromones libérées par les larves et résuspendez la pastille larvaire dans un millilitre d’eau. Diluer un aliquot de vers à un rapport d’un à 10 et ajouter 1:10 goutte de microlitre sur une lame de verre et compter les vers sous le microscope stéréo. Répéter pour obtenir un nombre moyen de vers.
Utilisez une pipette pour ajouter suffisamment de gouttelettes de la solution de ver sur une plaque NA22 à température ambiante pour ensemencer environ une fois 10 vers au tiers vers pour la culture et laisser la plaque à moitié ouverte jusqu’à ce que les gouttes se dessèchent. Puis incuber la plaque couverte et à l’envers à 20 degrés Celsius pendant environ 44 à 48 heures ou jusqu’à ce que les vers atteignent le stade L4 tardif tel que confirmé visuellement sous un microscope stéréo. Pour l’évaluation manuelle du SWIP, ajouter 40 microlitres de solution de contrôle avec ou sans amphétamine de 0,5 millimlaire dans une plaque de verre.
Sous un stéréoscope, choisissez huit à dix vers de stade L4 tardifs avec un pic de cils et submergez la pioche dans le puits contenant la solution jusqu’à ce que les vers se déplacent hors de la pioche et nager dans la solution. Démarrez la timer. Notez le nombre de vers relâchés dans le puits et observez et enregistrez le nombre de vers présentant le SWIP à chaque marque de minute pendant un total de 10 minutes.
À la fin de la procédure, copiez les données brutes dans une feuille de calcul et calculez le pourcentage de vers paralysés en divisant le nombre de vers paralysés à chaque minute par le nombre total de vers testés tout au long de l’analyse et en multipliant par 100. Copiez les valeurs en pourcentage dans n’importe quel logiciel graphique et statistique et tracez les données avec des valeurs en pourcentage de SWIP sur l’axe y et le temps sur l’axe x en utilisant le format graphique XY. L’analyse statistique entre les groupes traités par le contrôle et les amphétamines et l’heure du traitement peut être effectuée, par exemple en utilisant l’ANOVA dans les deux sens et l’analyse post-hoc.
Pour une analyse automatisée de la paralysie induite par la natation, configurez la caméra, le logiciel de suivi des vers et le script pour exécuter l’analyse logicielle de suivi et utiliser un pic de cils pour placer un seul ver L4 à un stade avancé dans une plaque de tache en verre comme indiqué précédemment. Enregistrez ensuite des vidéos de natation d’un ver à la fois et utilisez le logiciel de suivi des vers pour calculer la fréquence des courbures du corps, en suivant le script fourni avec le logiciel de suivi pour obtenir la fréquence de battement de ver, et pour générer des cartes thermiques à partir des données de thrashing ver. La plupart des vers testés dans la solution de contrôle nagent en continu pendant au moins 10 minutes.
Les vers exposés au contrôle ou aux amphétamines ne présentent pas de SWIP dans la première minute d’observation. Cependant, alors que les vers traités avec la solution de contrôle continuent de nager pendant 10 minutes, les vers traités avec de l’amphétamine commencent à présenter swip après deux minutes de traitement. Et après 10 minutes, 66% des animaux montrent SWIP.
Ici, des exemples de cartes thermiques d’animaux exposés à la lutte ou aux amphétamines sont montrés avec une augmentation considérable prévue de la paralysie observée chez les animaux traités aux amphétamines. Avant d’essayer cet essai, il faut bien connaître la cueillette et la mise en scène développementale de C.elegans. L’implication du système dopaminergique dans le comportement de SWIP devrait être confirmée utilisant des animaux manquant de l’expression des protéines dopaminergiques ou par l’épuisement des vésicules de dopamine avec reserpine.
Swip peut être instrumental dans l’identification de nouvelles protéines impliquées dans le mécanisme d’action des médicaments agissant à la synapse dopaminergique.
