זיהום תת עורי של סטפילוקוקוס אוראוס עמיד Methicillin (MRSA)

Summary

העור Murine מודל זיהום ברקמות רכות מנוצל להערכת תפקוד ארסיות של Staphylococcus aureus עמידים methicillin (MRSA) לבין התגובות החיסוניות המארח. כאן, הצגנו מודל זיהום תת עורי לעור זיהום ברקמות רכות.

Abstract

MRSA הוא איום עולמי לבריאות הציבור, עור MRSA ו ברקמות הרכות זיהומים עכשיו להסביר יותר ממחצית כל רקמות רכות זיהומים בארצות הברית. בין הרקמות הרכות זיהומים, שררת, pyomyositis ו fasciitis necrotizing דווחו יותר ויותר עם MRSA הנובעים הקהילה העמותה. כדי להבין את יחסי הגומלין בין MRSA ו חסינות המארחת מובילה לזיהום חמור יותר, הזמינות של מודלים של בעלי חיים הוא קריטי, המתיר את המחקר של המארח גורמים חיידקיים. מודלים זיהום מספר הוכנסו להעריך את בפתוגנזה של ס aureus במהלך דלקת עור שטחית. כאן אנו מתארים מודל דלקת תת עורית אשר בוחן את העור, תת עורית, ו פתולוגיות שריר.

Protocol

1. הכנת עבור זיהום MRSA (יומיים לפני הזיהום)

1. לחסן loopful של MRSA מתרבות המניות אגר דם (אגר Trypticase סויה (TSA)) צלחת.
2. בדוק את הפנוטיפ המוליזה (אזור המושבה ברור סביב כל אחת) בצלחת אגר דם.
3. פיק למושבה בעלת פנוטיפ המוליטית העולה בקנה אחד עם ניסויים אחרים.
4. לחסן את המושבה לתוך 3 מ"ל טוד יואיט מרק (THB), עם אנטיביוטיקה לעצמו, כאשר הצורך, צינור 15 מ"ל Snap-כתרים.
5. לדגור על 37 מעלות צלזיוס לילה עם רועד בסל"ד 220.

2. הכנת עכברים לזיהום (יום לפני הזיהום)

1. בהתאם לגודל של העכברים, לגלח את הפרווה מעל שטח 3 4 ס"מ בחלק האחורי של עכברים.
2. החל ~ 5 מ"מ ³ מסיר שיער שמנת (שנרכשו מרקחת מקומי) לאזור מגולח.
3. אפשר קרם להסרת שיער כדי לדגור על פני העור דקות בערך 1.
4. מגבות נייר רטוב עם DDH ₂ O.
5. נגבו את קרם להסרת השיער במגבת נייר רטוב.

3. הכנת עבור זיהום MRSA (ביום זיהום)

1. למהול את תרבית החיידקים לילה בשעה 1:500 ל 1:1000 עם 10 מ"ל של THB מראש התחמם, בתוך צינור 50 בורג הכתיר מ"ל.
2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך כ 2.5 שעות עם רועד בסל"ד 220 עד ₅₄₀ מגיע ל 2.5.
3. איסוף MRSA ידי צנטריפוגה XG ב 3225 ב 10 דקות 4 ° C.
4. בטל supernatant.
5. Resuspend גלולה חיידקים פוספט 10 מ"ל של Dulbecco שנאגרו מלוחים (DPBS).
6. חזור על שלבים 3 ו -4.
7. Resuspend גלולה חיידקים DPBS בריכוז הרצוי.
8. סדרתי לדלל את ההשעיה של חיידקי ינואר ¹⁰ - אוגוסט 10.
9. פלייט ההשעיה חיידקי מדולל על צלחות אגר דם.
10. דגירה צלחות ב 37 ° C במשך הלילה.
11. לצפות ולהקליט את הפנוטיפ המוליטית של inocula.
12. הרוזן המושבה הקמת יחידות (CFU) מספר על הצלחת.
13. חישוב inocula מבוסס על מספר CFU על הצלחת.

4. זיהום תת עורי של MRSA (ביום זיהום ו 3 ימים לאחר ההדבקה)

1. להזריק תת עורי 100 ההשעיה חיידקי μL באזור מגולח.
2. שימו לב החיות במשך 3 עד 5 שעות לאחר ההזרקה כדי לוודא העכברים בחיים.
3. שים את הנגע על הגב של החיות יום ולהקליט את אזור הנגע יומי כאשר הוא נחוץ. תצפית הנגע צריך לכלול הקלטה בגודל הנגע מורפולוגיה ו. גם העור ונגעים שריר נבדקת ונרשמת על ידי הכפלת אורך ורוחב של הנגע. נגעים לא סדיר בצורת צריך להיות שבור למטה לתוך חלקים סימטריים קטנות יותר, כל חתיכה נמדד באותה שיטה. מדידות הנגע יכול גם להשתמש בתוכנית בסיוע מחשב הערכה histomorphometric (ImageJ, קוד פתוח זמין מ-NIH ב http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) ^2.
4. הקורבן חיות ביום 3 שלאחר זיהום על ידי שאיפה של isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם.
5. לצפות ולהקליט את הנגע על פני העור.
6. ניק את העור עם זוג מספריים סטרילית.
7. מקלפים את עורו בזהירות לצפות ולהקליט את הנגע על השריר.
8. הנגע והבלו ו כ 2-5 מ"מ של האזור שמסביב.
9. איסוף הטחול והכליות.
10. Homogenize הרקמות באמצעות homogenizer רקמה או על ידי יישום חוזרות ונשנות של הבוכנה של מזרק 1 מ"ל לצינור microfuge המכיל את רקמות 100 μL של DPBS.
11. הוספת 900 μL של DPBS אל צינור אחד.
12. וורטקס דגימות דקות 5.
13. סדרתי לדלל את ההשעיה עם DPBS ינואר ¹⁰ - יוני 10.
14. פלייט השעיות מדולל על צלחות THA.

5. נציג תוצאות:

1. מיד לאחר כל הזרקה תת עורית, בועה יהיה שנצפה על פני העור כאשר הזיהום נעשה כראוי (איור 1 א). אם לא בועה הוא ציין על פני העור, הזרקה עלולה להיות עמוק מדי, זה עלול להשפיע על תוצאות הזיהום (בגודל הנגע, CFU).
2. השעיית חיידקי צריך להיות מדולל באופן סדרתי CFU את הצורך להיבדק על צלחות אגר דם עבור כל ניסוי. פעולה זו תניב מידע חשוב: 1) אם inocula יש פנוטיפ הומוגנית; 2) את הספירה המדויקת חיידקי קיימא עבור הזיהום.
3. הנגעים והישרדות חיידקי ניתן להעריך בנקודות זמן שונות לאחר הפגיעה. הנה, בחנו את זיהום ביום 3 שלאחר זיהום. גודל הנגע מנותחים על פני העור (1B איור: 1x 10 ^9; 1D איור: 1 x 10 ⁷ CFU) ועל פני השטח את השריר (תרשים 1C: 1x 10 ⁹ ; איור 1E: 1 x 10 ⁷ CFU). אזור הנגע שווה אורך (מ"מ) x רוחב (מ"מ) ניתן למדוד להערכת נזק לרקמות (איורים 2 A ו-B). תוצאה זו יכולה לעזור לקבוע את מידת הנזק לרקמות שנגרם על ידי גורם ארסיות נתון. בנוסף, נגעים הם נכרת, ומעורים ב DPBS, ואת מצופה כדי לכמת את מספר CFU (איור 2 ג), אשר מציין את הכדאיות של החיידקים באתר זיהום.

באיור 1. העור ונגעים השריר. CD1 העכברים היו מחוסן תת עורית על צלע אחת עם MRSA (LAC). התמונות צולמו 0 זמן ביום 3 שלאחר זיהום. (א) זמן 0 שלאחר זיהום (PI), (ב) - (ז) 3 יום pi, ב ', ד' ו-F: נגעים בעור, C, E, ו-G: פצעים שריר, B ו-C: 1x 10 ⁹ CFU נגוע, D ו-E: 1x 10 ⁷ CFU נגוע, F ו-G: מדומה.

איור 2. הנגע בעור גודל וחיידקים קיימא לספור באתר זיהום ביום עור 3. שלאחר דלקת שריר נגעים על MRSA (LAC) CD1 עכברים נגועים. (א) גודל הנגע בעור. (ב) שריר גודל הנגע. (ג) סך CFU רקמות. H: 1 x 10 ⁹ CFU inocula: L: 1 x 10 ⁷ CFU inocula. * P <0.05, Mann-Whitney הבדיקה.

Discussion

1. העור Murine מודל זיהום ברקמות רכות הוא כלי רב עוצמה עבור בהערכת ארסיות vivo של הפתוגן. Pathogenicity ש aureus זיהום רקמת העור רך עשוי להשתנות בהתאם למספר פרמטרים. אלה כוללים את גודל inoculum, שלב התפתחות חיידקים, עומק של חיסון, גיל של עכברים, על רקע גנטי העכבר <...

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
THB		VWR	95025-314
DPBS		Invitrogen	21-031-CV
1 ml syringe		BD	309602
27G1/2 needle		BD	305109
Sheep Blood Agar (TSA)		VWR	90004-328