הידרופובי אוטומטי אינטראקציה כרומטוגרפיה טור בחירה עבור שימוש ב טיהור חלבון

Summary

שיטה אוטומטית לזיהוי מתאימים הידרופובי כרומטוגרפיה אינטראקציה (היק) התקשורת כדי לשמש בתהליך של טיהור חלבון מוצג. השיטה משתמשת בינוני הלחץ כרומטוגרפיה נוזלית כולל מערכת מיזוג חיץ אוטומטי, הזרקת לולאה דגימה דינמי, בחירת העמודה רצף, רב גל ניתוח, חלק פיצול אוסף eluate.

Abstract

בניגוד לשיטות אחרות chromatographic טיהור חלבונים (למשל סינון בג'ל, זיקה, ואת חילוף יונים), כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופובי (היק) בדרך כלל דורש נחישות ניסיוני (המכונה ההקרנה או "צופיות") על מנת לבחור את המדיום המתאים ביותר chromatographic לטיהור חלבון נתון ^1. השיטה המוצגת כאן מתארת ​​גישה אוטומטית צופיות, לתקופה של התקשורת היק אופטימליים כדי לשמש טיהור חלבונים.

היק מפריד חלבונים ביומולקולות אחרים lysate גולמי על בסיס הבדלים hydrophobicity. בדומה זיקה כרומטוגרפיה (AC) ואת חילוף יונים כרומטוגרפיה (IEX), היק מסוגל לרכז את החלבון של עניין תוך כדי התקדמות בתהליך chromatographic. חלבונים המתאימים ביותר על ידי היק לטיהור כוללים את אלה עם אזורי משטח הידרופובי ומסוגל לעמוד החשיפה מלח בריכוז העולה על תחמושת מ 2nium סולפט ((NH _{4) 2} SO _4). היק נבחר לעתים קרובות כשיטה טיהור חלבונים חסרי זיקה תג, ואינם מתאימים ולכן על AC, וכאשר IEX אינה נותנת טיהור נאותה. Moieties הידרופובי על פני החלבון באופן זמני להיקשר ליגנד פולרי מצמידים את מטריקס, נייח נייח. האינטראקציה בין חלבונים ליגנד הם תלויים במידה רבה על ריכוז מלח למאגר זורם דרך העמודה כרומטוגרפיה, עם ריכוזים יוניים גבוהים לחיזוק האינטראקציה חלבונים ליגנד ולהפוך את החלבון נייח (כלומר כבול בתוך הטור) ^2. כמו ירידה בריכוז המלח, אינטראקציה חלבון ליגנד מתפוגג, חלבון שוב הופך נייד elutes מהעמודה. התקשורת היק כמה זמינים מסחרית מראש ארז עמודות, שכל אחת מהן מכילה 1 של ligands הידרופובי מספר (למשל S-בוטיל, בוטיל, octyl, ואת פניל) צולבים על צפיפויות שונות כדי חרוזים agarose של המפרטific בקוטר ^3. טור אוטומטי צופיות מאפשר גישה יעילה בקביעת היק התקשורת צריכה להיות מועסק על ניסויים עתידיים, אופטימיזציה ממצה יותר וטיהור החלבון מפעילה ^4.

החלבון הספציפי מטוהרים כאן הוא רקומביננטי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), אולם הגישה יכול להיות מותאם לטיהור חלבונים אחרים עם אחד או יותר אזורים משטח הידרופובי. GFP חלבון משמש מודל שימושי, בשל יציבותו, ספיגת ייחודי שיא האור 397 ננומטר, ואת הקרינה בעת חשיפה לאור UV ^5. Lysate בקטריאלי המכיל GFP סוג בטבע הוכן מאגר גבוהה מלח, נטען לתוך ביו רד הלחץ DuoFlow מערכת בינונית כרומטוגרפיה נוזלית, ואת ספוחים לסחף נחלי לטורים המכילים HiTrap היק היק מדיה שונים. חלבון היה eluted מן העמודים ונותחו על ידי line-in ופוסט להפעיל שיטות זיהוי. מיזוג חיץ, הזרקת לולאה דגימה דינאמית, קול רציףהבחירה umn, רב גל ניתוח, חלק פיצול אוסף גדל eluate את הפונקציונליות של המערכת, שחזור של גישה ניסויית.

Protocol

1. מאגר ו הכנת דוגמאות

1. הערה טכנית: מאגרים כל צריך להיות בקירור כל צעד של פרוטוקול זה יש לבצע על הקרח או על 4 ° C, אלא אם צוין אחרת. הטמפרטורה הנמוכה היא חיונית כדי למנוע את הפירוק של החלבון כדי להיטהר, ולהבטיח תנאים אופטימליים ההפעלה. התקשורת היק עשוי להניב תוצאות שונות אם ההפרדה פעלה בטמפרטורת החדר, ומערכת כרומטוגרפיה צריכים להיות מופעלים תיבת 4 C בחדר קר או קר °.
2. הכינו 500 מ"ל של מאגרים אלה: 200 מ"מ לאא ₂ PO ₄ (מאגר A1), 200 מ"מ Na ₂ HPO _4, (מאגר A2), ו - 4.8 מ '(NH _{4) 2} SO ₄ (B2 Buffer). מים Deionized (B1 מאגר) ישמש גם. דגה למאגר כדי להבטיח אופטימליות תנאי ההפעלה chromatographic. Maximizer מערכת ישתלבו יחד Buffers A1 ו-A2 ליצור נמוכה מלח elution חיץ פוספט, וזה יהיה למזג Buffers B1 ו-B2כדי ליצור את גבוהה אמוניום סולפט מלח תחילת חיץ (2.4 מ '(NH _{4) 2} SO _4).
3. הכן 20 מ"ל של המדגם להיות טעון על ידי ערבוב 10 מ"ל של lysate התא המכיל את החלבון כדי להיטהר עם 10 מ"ל של B2 המאגר. אמוניום סולפט בריכוז סופי של הפתרון lysate תא המדגם צריך להיות כ 2.4 מ '(NH _{4) 2} SO _4, מה שהופך אותו פחות או יותר שווה ערך למאגר ההתחלה. Lysate התא יכול להיות מוכן על ידי resuspending תא גלולה החיידקים TE חיץ (10 mM טריס 1 mM EDTA, pH 8.0) ואחריו sonication או תוספת של 1 מ"ג / מ"ל ​​ו ליזוזים צנטריפוגה ב 3700 × g למשך 10 דקות.
4. לסנן את התערובת lysate-למאגר באמצעות חלבון נמוכה מחייב 0.45 מזרק מיקרומטר מסנן להסיר חומר חלקיקי מפתרון. שמור את המדגם על הקרח עד שהוא מוכן להיות טעון לתוך המערכת.

2. התקנת אינסטלציה פיזית של מערכת כרומטוגרפיה DuoFlow

1. להבטיח את כל הכוח המכשיר חיבורי תקשורת מורכבים. התקנים צריכים להיות גלויים DuoFlow ביולוגיים חלון כרומטוגרפיה התוכנה ידנית מלאה. סיכום של מכשירים מפורטים בטבלה 1. איור של מערכת ותרשים הצנרת היא באיור 2.
2. צרף חיבורי חשמל עבור שסתומי אל תחנת העבודה ומערכת משאבת יציאות Maximizer כאלה מספור יציאת בעקבות רצף הגיוני. לרשום על כל שסתום עם מספר היציאה שלו בהתאמה לשימוש עתידי. תחנת עבודה משאבת Maximizer מערכת לשמש את חיבורי התקשורת העיקריים בין המחשב / בקר מערכת כרומטוגרפיה. שסתומים יוכרו באופן אוטומטי ומוצגים תוכנה כאשר הוא מחובר למכשיר אחד.
3. הערה טכנית: בעוד בהפעלת המערכת כרומטוגרפיה במצב ידני, שסתומים נשלטים באופן עצמאי. תשמרי על עצמך כדי לוודא את הנתיב הרצוי זרימת מוגדר, במיוחד כאשר מחליפים שסתומים, לפני ביצוע חובבאה לזרום.
4. לצלול לתוך צינורות טפלון Buffers A1, A2, B1, B2 ו -. להבטיח כמויות מספיקות של חיץ זמינים עבור הפרוטוקול כולו צינורות, כי ימשיכו להישאר מתחת למים. הכנת 500 מ"ל של Buffers A1, A2, ו-B2 ו - 1 ליטר של B1 מאגר יהיה הולם.
5. פלאם מדגם טוען השסתום לולאה דגימה דינמי כפי שמודגם באיור 2, לפי הוראות היצרן. חבר את הלולאה מדגם מדגם שסתום היניקה (קבוצה 3) באמצעות אורך הקטן ביותר של צינור אפשרי. זה יהיה למזער דילול המדגם במהלך תהליך הטעינה של המדגם.
6. לצמצם את אורך הצינור בין המדגם, טוען משאבת המדגם, טוען מדגם שסתום היניקה (קבוצה 2). זה יקטין את כמות מדגם צורך לטעון את הלולאה המדגם.
7. להכין 8 זוגות זהים בגודלם של צינורות 1/16 OD "פיק, עם כל זוג חברו יחד על ידי האיחוד 1/4-28 נקבה female-to-1/4-28. חברו את זוגות לעמדות 1-8 של עמודה 2 הבחירה שסתומים. 7 האיגודזה קשור קו לבחירה העמודות תפקידים שסתום 2-8 יהיה מאוחר יותר להיות מוחלף על ידי העמודים כרומטוגרפיה להיבדק. האיחוד מוטבעות הקשור לעמדה 1 יישמר כפי עוקף טור כרומטוגרפיה.
8. הערה טכנית: יש לוודא כל זוג צינורות מחוברים תנוחה משני שסתומים בחירת עמודות.
9. הפעל UV הן 4 גל / גלאי Vis (QuadTec) המנורה קבועה באורך גל 280 ננומטר מנורת UV גלאי. אורכי הגל כדי להימדד QuadTec עבור פרוטוקול זה כוללות 214 ננומטר, 280 ננומטר, ו 397 ננומטר. מדידת 280 ננומטר עם גלאי הן קבועה באורך גל UV ו QuadTec מספק יתירות של המערכת מבטיחה תקפות הנתונים.
10. לאשר את כל גלאי מכוילים לפי הוראות היצרן. הרגולטור backpressure יש צורך להפחית את הצטברות אוויר בועה גלאי ו יש להתקין את זרם של גלאי, אך עד זרם של צג ה-pH.
11. המערכת המוצגת כאן כוללת 2 fractioנ אספנים, אשר מספק נוחות משמעותית לניתוח שלאחר הריצה eluate. צרף את אספנים שבר, שסתום זרם ספליטר, הבקר מפצל כפי שמודגם באיור 2. אספן חלק מחובר מיקום 1 של שסתום ספליטר תאסוף 900 ​​שברים eluate μl ב 12 צינורות תרבות מ"ל, בעוד אספן חלק מחובר קבוצה 2 תאסוף 100 שברים eluate μl ב 96 צלחות microtiter גם.
12. 2 קבוצה חלק אספן, ספליטר שסתום, ואת ספליטר בקר מופעלים מחובר בתחנת העבודה של כרומטוגרפיה. בקר ספליטר נכלל בתוך משאבת ביו רד Gradient Econo, עם זאת, רכיב המשאבה של המכשיר אינו בשימוש. "פיצול%" הגדרת אפשרות יוצג על משאבת צבע Econo כאשר שסתום מפצל הוא מחובר אליו.
13. סט פיצול% עד 10. 1 תפקיד נציב חלק תאסוף 90% eluate (900 μl / חלק), ו 2 קבוצה אספן חלק תאסוף10% (100 μl / חלק). את אספנים שברים יקדם בתיאום המאפשר מספרים שבריר אספנים שני להתכתב אחד עם השני.
14. להחליף חלק סטנדרטי אספן הראש טיפה על אספן 2 חלק קבוצה עם ראש טיפה microplate. הראש טיפה microplate יש צמצם קטן יותר, המאפשרת איסוף של גדלים ירידה 50% קטן יותר (כלומר 25 μl במקום μl תקן 50), והוא מועיל במיוחד כאשר איסוף ≤ 500 שברים μl.
15. שימוש בלוח הבקרה על המסך, קבע את מיקום 2 אספן חלק לאסוף שברים של לוחות 96-היטב מראש בשיעור של מדגם 1 / דקה. בקר ספליטר ו 2 קבוצה אספן חלק יופעלו באופן ידני מיד לאחר תחילת הריצה כרומטוגרפיה 1.
16. לשטוף 2 מיקום השבר אספן טיפה את הראש microplate עם B1 המאגר.

3. מערכת תחול קווים, שיטת הפעלה תכנות Equilibratלאינג היק עמודות

1. עם מערכת Maximizer קווי כניסת שקוע לתוך Buffers degassed A1, A2, B1, B2 ו, ראש תחנת עבודה משאבות, לשטוף לולאה המדגם, לרוקן את המערכת כרומטוגרפיה לפי הוראות היצרן. תחול צעד השלם עם כל 4 פתחי הכניסה מערכת Maximizer (A1, A2, B1, B2 ו) כדי להסיר בועות אוויר שנשארו.
2. הכנת המערכת דורשת הפעלה ידנית של בקר המערכת באמצעות תוכנת ביולוגיים. לאשר את המיקום הנכון של שסתום מדגם העומס ובחירת שסתומי עמודה לפני הפעלת זרימת המאגר.
3. הכן להתחיל מ"ל ידנית 1 / זרימה דקה מאגר elution (0% ב ') באמצעות המערכת, כמתואר צעדים 3.4-3.5.
4. בחלון ההתקנה של התוכנה תוכנית ביולוגיים, בחר "השתמש מיזוג מאגר" ו "מאגר פוספט אמוניום סולפט עם". אשר Buffers A1, A2, B1, B2 ו - מופיע חלון ההתקנה מתאימות הסיכומים.
5. להגדיר באופן ידני את קצב זרימת מ"ל 1 / דקה של חיץ elution(0% B). שימו לב backpressure, מוליכות, העתקים UV, ו-pH להישאר עקביים בגבולות הפעלה רגילים. מומים עולה באוויר או חסימה עמודה להתייחס לפני שתמשיך.
6. ריקון כל 8 הבחירה קווי עמודה עם חיץ מ"ל 5 elution. עושים זאת על ידי 1 עצירת זרם, הגדרת שני שסתומים הבחירה עמודה לעמדה 2, ואת חידוש 1 מ"ל / דקה זרימת, ב 0% חזור לבחירת שורות ועמודות בעמדות 3-8.
7. חבר 1 HiTrap מ"ל עמודות היק לעמדות 2-8 של שסתומים הבחירה העמודות. השלם את השלבים 3.8-3.13 עם עמודה אחת בכל פעם. שימו לב איזו עמודה היק מושם בו שסתום עמדה הבחירה. סיכום של מאפייני התקשורת היק עמודה מופיעה בטבלה 2.
8. חיבור פיזי של עמודות GE Healthcare HiTrap למערכת DuoFlow ביו רד דורש סדרה של אביזרי ניצול 1/4-28, M6, ואביזרים Luer. הסר את האיחוד המחבר בין 2 מיקום העמודות שסתומים הבחירה.lign ביו רד ו-GE אביזרי בריאות כפי שמודגם באיור 3.
9. צרף אביזרי עמודות המעלה אל DuoFlow. למנוע השמנה בועות אוויר בעמודה או צינורות ידי בחוזקה את אביזרי העמודות הזרם הולם בחירת הזרם שסתום. הפעלה מאגר elution באמצעות אביזרי עד כל האוויר מסולק וירידה גדולה של מאגר קיים. לעצור באופן זמני את זרימת המאגר.
10. הסר את הפקק המחובר כניסת טור ומניחים ירידה גדולה של המאגר נמוכה מלח (0% ב ') בחלק העליון של העמודה. צרף את העמודה אביזרי במעלה הזרם. שיש גם כניסת טור והתאמת כניסת גדוש טיפות חיץ מבטיח חיבור ללא בועות אוויר.
11. אם העמודה נמצא בשימוש בפעם הראשונה, הצמד את הקצה לשקע העמודה. חבר את מוצא את אביזרי העמודות במורד הזרם ו שסתום צינורות הבחירה. בדוק את כל אביזרי הם מהודקים היטב.
12. הגדר את הגבול backpressure ל -40 PSI. לשטוף את העמודה With 5 עמודות כרכים (5 כרכים העמודות = 5 מ"ל) של חיץ elution (0% ב ') בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה. המשך לשטוף את העמודה, אם יהיה צורך, עד pH, העתקים UV ו backpressure התייצבו.
13. לשטוף את הטור עם 10 כרכים עמודה (10 מ"ל) חיץ התחל (100 ב%) בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה. המשך לשטוף את העמודה, אם יהיה צורך, עד פרמטרים במערכת ברשימה בשלב מוליכות הקודמת, כמו גם לא התייצב.
14. טור היק מוכן מעל מוכן כעת טוען המדגם. פעם אחת את כל העמודות להיבדק מוכנים, לעבור באופן ידני את הבחירה שסתומים העמודות למיקום 1 (איחוד) ולהפסיק את זרימת המאגר.

4. לדוגמא טוען

1. מדגם לצלול לתוך כניסת צינור דגימה 20 מ"ל כדי להתחיל בתהליך של מדגם טוען לתוך הלולאה מדגם דינמי. מחלון הגדרה ידנית של תוכנות ביולוגיים, עבור לולאה עומס מדגם / לשטוף את שסתום למיקום 1 (לדוגמא) ואת השסתום מדגם טוען לטהר.
2. ליזום פעולה שללולאה דגימה משאבת טוען, עריכת מדגם לתוך צינור המשאבה בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה, עד מיד לאחר המדגם מגיע שסתום טוען המדגם. זה מסיר ו חיץ / או אוויר מהקו עומס המדגם.
3. לעצור את הזרימה של המשאבה הטעינה ולעבור שסתום טוען מדגם טהר לטעון. הפעל מחדש את לולאה דגימה משאבת טעינה בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה עד 10 מ"ל של מדגם כבר נשאב לתוך לולאה דגימה דינמי.
4. המדגם מספיק טעון כעת עד 10 ריצות עוקבים העמודות היק צופיות לתוך הלולאה מדגם דינמי.

5. תכנות שיטה תוכנה הפעלת פרוטוקול טור צופיות

1. בחלון ההתקנה על תוכנת ביולוגיים, בחר את ההתקנים של המערכת המסומנים בכוכבית בטבלה 1.
2. בחר 6 עמודות היק כדי assay. תוכנית שיפוע ליניארית המלח יורד ו -6 עמודות שיטת צופות, כפי שמודגם בטבלה 3. התוכנית היא שיטת modificatיון של התקנת התוכנה ביולוגיים טור היק ו עבר אופטימיזציה עבור היישום הנוכחי.
3. השיטה 6 טורים צופיות מומלץ בשל מגבלות אספן שברים. 7 כל העמודות ניתן מסייר אם השיטה התוכנית מותאמת לאסוף כמויות גדולות יותר שברים. אל תוסיף את הצעד צופיות עד התוכנית תושלם אחרת, כמו בחירת מאפיין צופיות מונע עריכת שלאחר מכן.
4. להתחיל לרוץ צופיות. להתחיל באופן ידני חיץ התחל (100% B) זרימה, 1 מ"ל / דקה. לחץ להתחיל בבקר ספליטר להתחיל 90% -10% eluate זרם פיצול בין 12 מ"ל תרבות אספן חלק הצינור (קבוצה 1) ו 96-גם חלק צלחת אספן (קבוצה 2), בהתאמה. טכני לב: היזכרו 96-גם חלק אספן צלחת מופעל מנותק מהתוכנה ביולוגיים.
5. הפעל את השיטה התוכנית. מיד לאחר תחילת הריצה שיטת התוכנית, לחץ להתחיל בלוח הבקרה של המסך מחובר 96-גם צלחת fraction אספן. אם שני אספנים שברים הם לא 100% סינכרוני, ידני לקדם את השבר מחובר 96-גם אספן צלחת כאספן ההתקדמות אחרים שברים על צינור חלק 2 אוסף.
6. שימו לב תצוגה בזמן אמת על מנת לאשר פרמטרים לרוץ צפויים. ב Backpressure, מוליכות, ואת% (איור 4) מנוהלים הפרמטרים ניתן לפקח על מנת להבטיח טור אל הטור שחזור של התנאים לרוץ. מיקום הברז, pH, וטעינה מדגם צריך גם להיות פיקוח. עקבות קרינה ניתן להשוות לוודא זרימה דרך דומה פסגות elution.
7. להשתמש ב-line ופוסט להפעיל טכניקות ניתוח eluate לזהות את הפרופיל elution וטיהור של חלבון של עניין (כלומר, "חלבון המטרה").
8. לקבלת דוגמיות המכילים GFP, לצפות elution ב-line באמצעות ספיגת UV ייחודי של חלבון ב 397 nm. להשוות את ה-GFP ספציפי ספיגת 397 ננומטר מעקב כדי ספיגת החלבון 280 ננומטר בכלל מעקב להעריך ההפרדה יחסיתוטיהור באמצעות כלי התקשורת השונים היק להיות מסייר (איור 5).
9. לאחר הניתוח בטווח של ה-GFP וחלבונים אחרים היעד יכול להיות מושג באמצעות מספר שיטות. Aliquots של μl 5-50 מתוך 96, גם שברים צלחת ניתן להעביר לצלחת טריים assayed עבור תכולת החלבון הספציפי של ELISA או כתם המערבי, ואת תכולת החלבון הכולל של חלק זה ניתן לנתח באמצעות קונבנציונאלי SDS-PAGE או Experion microfluidic מערכת אלקטרופורזה. GFP הקרינה ניתן להבחין ב -12 תרבות צינורות מ"ל באמצעות אור UV (איור 6).
10. זיהוי של רוב כלי התקשורת היק המבטיחים ניתן לקבוע על ידי השוואה של ה-GFP elution ביחס חלבונים אחרים הכלולים במדגם. טיהור עם התקשורת היק המבטיחים ביותר אז יכול להיות מותאם על פי פרמטרים אחרים, כולל סוג וריכוז חיץ ההתחלה pH.
11. טכנית הערה: בתום הניסוי, מקם את כל קווי כניסת לתוך מאגר B1 (degassedH ₂ O) וביסודיות לשטוף את משאבות, שסתומים, וכל צינורות מים. אחר הוראות היצרנים לניקוי אחסון לטווח ארוך של מערכת כרומטוגרפיה ועמודות היק.

6. נציג תוצאות:

נציג שיפוע היק מלח, מוליכות, לחץ בעמודה של ריצות צופיות מוצגים באיור 4. שינוי בריכוז המלח (קו כחול), כפי שהיא נמדדת באחוז חיץ להסיק גבוהה מלח קווי חיץ אופייני המתודולוגיה היק. כמו ריכוז המלח יורד, חלבונים חייב elute העמודה. מוליכות (קו אדום), אשר תואמים את ריכוז מלח ציין, נמדד קו מייד לאחר גלאי QuadTec UV. מחוץ לסט בין שיפוע מלח עקבות מוליכות מציין את הזמן הנדרש למאגר לנוע בין כניסת חיץ, באמצעות המערכת, וכן לפקח על מוליכות. במהלך ריצת המדגם, לאהוא לחץ במערכת (קווים אפורים) ו pH נשארים קבועים יחסית.

איור 5 מראה chromatograms של עוקבים ריצות העמודות היק צופיות. איתור ב-line של החלבון הכולל _(280, קו כחול) ו-GFP _(397, הקו הירוק) נעשית על ידי מדידת ספיגת אור ב 280 ננומטר ו 397 ננומטר, בהתאמה. אפשר שפע GFP משוער יחסית והפרדה עבור כל סיבוב צופיות על ידי השוואת שני הקווים. GFP חייב את העמודות היק הנבדקים עם דרגות שונות של זיקה ופרופיל elution שלה מגוונים. בחירת עמודה היק המועדפת purifications בעתיד מבוסס על זיהוי טור שמייצר elution החדה ביותר GFP שיא ההפרדה הגדול ביותר של חלבונים אחרים.

באיור 6, צינורות תרבות שברים 10, 12, 14, 16, ו -18 של FF Phenyl (תת גבוהה) צופיות הריצה היו תחת דמיינו חדר הסביבה (ניאון) אור אולטרהסגול (UV). נתפסו שני צינורות עם הפנים קדימה (לוחות משמאל) מלמעלה למטה (לוחות הנכונים) על מנת לבחון את ספקטרום אופייני פליטת ה-GFP. GFP (ירוק) הוא זוהה בבירור שתי תמונות סגול בשבריר 14. אלה שלאחר לרוץ נתונים מתאימות יפה עם גילוי שורת ה-GFP על ידי מדידת ספיגת eluate ב 397 ננומטר _(397, הקו הירוק), אשר מזהה גם שבר 14 כמכיל השיא העיקרי של ה-GFP eluted. כחול מפוזר בלוח UV שמאל נפלט האור של מנורת UV.

באיור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקול זה. Lysate בקטריאלי המכיל חלבון של עניין (GFP, חלבון המטרה) מוכנה, בדילול למקבילה גבוהה מלח למאגר למאגר תחילת כרומטוגרפיה, ומסוננים. לאחר מערכת כרומטוגרפיה נוזלית מוכנה, מדגם טעון חלבון המטרה היא להפריד חלבונים אחרים הכילו אניעכ lysate באמצעות מדיום כרומטוגרפיה הידרופובי הכלול טור מראש ארז היק. שיטת ההפרדה חוזר על עצמו מספר פעמים באמצעות כרומטוגרפיה מדיה שונים (המכונה טור צופיות) על מנת לקבוע אילו התקשורת מספק ההפרדה GFP הטוב ביותר. החלבונים eluted (eluate) מנותחת מקוון באמצעות גלאי הכלולים במערכת כרומטוגרפיה והוא נאסף אל תוך שברים קטנים יותר לניתוח (לאחר ריצה) לאחר מכן. בהתבסס על ניתוח קו ואחרי ריצה של פעילות ה-GFP והפרדה, טור היק אופטימלית ובינוניים chromatographic מזוהים.

טבלה 1. מערכת מפתח כרומטוגרפיה רכיבים המשמשים פרוטוקול זה.

איור 2. תרשים של ביו רד מערכת DuoFlow בינוני בלחץ הנוזל כרומטוגרפיה מועסקים. התכונות העיקריות של סאישאלה כוללים מיזוג חיץ אוטומטי, טעינת המדגם לריצות העמודות רציפים, הבחירה האוטומטית של עמודות כרומטוגרפיה שונות, שורת ניתוח eluate, ואיסוף טנדם של eluate מופרדים. ראו טקסט טבלה 1 לקבלת פרטים.

לוח 2. מאפיינים biophysical של התקשורת היק נבדק. שם העמודה היק HiTrap מעיד על ליגנד, צפיפות ליגנד, וגודל חרוז.

* FF = זרימה מהירה, HP = ביצועים גבוהים. גודל חרוז גדול מגדילה את קיבולת ליגנד מחייב קצב הזרימה. גודל חרוז קטן יותר מגדיל רזולוציה chromatographic. מידע שמקורם בספרות המסופק על ידי היצרן.

איור 3. חיבור של הטור בריאות HiTrap GE היק כדי ביו רד DuoFlow system.To אגוז הזרם Delrin 1/4-28ND טבעת חזוק (A1), מתאים Luer זכר אל הנקבה 1/4-28 (B1) זכר 1/16 "אל נשי הולם Luer (C) מחוברים. אביזרי הם מייחסים טור HiTrap לאחר סמוק חיץ ויש להם בועות כל מוסר. לשקע עמודה מחובר נקבה 1/16 "אל זכר מתאים M6 (ד '), זכר Luer ל הולם M6 הנשי (E), ונקבה Luer אל נקבה 1 / 4-28 מתאים (ב _2). מכלול זה כולו מחובר אגוז Delrin במורד 1/4-28 ואת טבעת חזוק _(2). הפאנל העליון ניתן לראות את אביזרי נפרדו התחתון מציג את לוח אביזרי הנאספים.

צעד	נפח (מ"ל)	תאור	פרמטרים
1	0.00	לאסוף שברים 1.0 מ"ל במהלך הריצה כולה
2	0.00	Switפרק עמודות	טור היק 1 (קבוצה 2)
3	0.00	Isocratic Flow	pH: 6.80 100% ב	נפח: 2.00 מ"ל זרימה: 1.00 mL / min
4	2.00	אפס Baseline	QuadTec
5	2.00	אפס Baseline	גלאי UV
6	2.00	מזריקים לדוגמא	לדוגמא טען Dynamic Loop	Auto להזריק Valve נפח: 0.50 מ"ל זרימה: 1.00 mL / min
7	3.00	Isocratic Flow	pH: 6.80 100% ב	נפח: 5.00 מ"ל זרימה: 1.00 mL / min
8	8.00	שכבות צבע	pH: 6.80 100% ב -> B 0%	נפח: 10.00 מ"ל זרימה: 1.00 מ"ל/ דקה
9	18.00	Isocratic Flow	pH: 6.80 0% ב	נפח: 3.00 מ"ל זרימה: 1.00 mL / min
10	21.00	Isocratic Flow	pH: 6.80 100% ב	נפח: 5.00 מ"ל זרימה: 1.00 mL / min
11	26.00	החלף עמודות	התאחדות (קבוצה 1)
סוף	26.00	בסופו של פרוטוקול	באופן אוטומטי חזרות עם 5 עמודות היק נוספים (עמדות 3-7)
סקאוט סוג		מספר מסלולים: 6	מספר צעדים מסייר: 1

3. לוח ביולוגיים תוכנה פרוטוקול שיטה צופיות היק מועסקים.

איור 4. נציג שיפוע היק מלח, מוליכות, והלחץ העמודה. כמו ריכוז מלח (הקו הכחול) יורדת, המוליכות (קו אדום) עושה גם כן. קיזוז בין שיפוע מלח עקבות מוליכות עולה הזמן הנדרש למאגר לנוע בין כניסת חיץ לצג מוליכות. הלחץ במערכת (קווים אפורים) נשארת קבועה יחסית במשך כל הריצה צופיות.

באיור 5. Chromatograms אתריהם טור HiTrap רציף היק צופיות ריצות. איתור ב-line של החלבון הכולל _(280, קו כחול) ו-GFP _(397, הקו הירוק) נעשית על ידי מדידת ספיגת אור ב 280 ננומטר ו 397 ננומטר, בהתאמה. בסדרה של ניסויים, elution החדה ביותר שיא GFP נצפתה עם FF Phenyl (תת גבוהה) גolumn. FF Phenyl (תת גבוהה) טור הופיעו גם כדי לספק את ההפרדה הגדולה ביותר בין ה-GFP וחלבונים אחרים. נוספים 1 HiTrap מ"ל עמודות היק נבדק כלל זרימת Phenyl החלפה מהירה נמוך (Phenyl FF (תת נמוכה)), זרימת בוטיל מהירה (בוטיל FF), בוטיל-S זרימה מהירה (בוטיל-S FF), וזרימה מהירה octyl (octyl FF) .

איור 6. לאחר ריצה נציג להדמיה של ה-GFP ב eluate המדגם. שברים Eluate נאספו בשיעור של 1/minute, וכל אחד מהם נותח עבור תוכן ה-GFP. בנתון זה מייצג, צינורות תרבות שברים 10, 12, 14, 16, ו -18 של FF Phenyl (תת גבוהה) צופיות הריצה היו תחת דמיינו חדר הסביבה (ניאון) אור אולטרה סגול (UV). נתפסו שני צינורות עם הפנים קדימה (לוחות משמאל) מלמעלה למטה (לוחות הנכונים). כחול מפוזר בלוח UV שמאל נפלט האור של מנורת UV. GFP (ירוק) הוא זוהה בבירור fraction 14 בשתי התמונות UV. הפאנל העליון מציין את החלבון הכולל (A280, קו כחול) ו-GFP _(397, הקו הירוק) העתקים הכרומתוגרמה של 5 שברים להיות דמיינו.

Discussion

טכניקות כרומטוגרפיה נוזלית הוכיחו ערך רב להכנת חלבונים מטוהרים מאוד הדרושים לביצוע ⁶ החיסונית, ביוכימי ^{7, 8} מחקרים מבניים. שיטות טיהור היק לרוב דורשים קביעת אמפירית של המדיום המועדף, והמבנה ליגנד, צפיפות ליגנד, ואת מטריקס תכונות חרוזים כל הוכחו להשפיע על תוצאות chromatographic ^{2, 3.} טור אוטומטי צופיות היא גישה יעילה לבחירת בינוני היק לאופטימיזציה לאחר וטיהור חלבון ^4. שיטת הטור אוטומטי צופיות הציג ניתן להתאים בקלות אסטרטגיות שונות טיהור היק חלבון. שינויים בריכוז המלח, הבחירה מלח, צבע מלח, pH עשוי לשפר עוד יותר את התנאים טיהור, ואת ההשפעות של משתנים אלה פרמטרים חיוניים נבדקו קודם לכן ^13,14. Eluate היק המכיל prote היעד מטוהרים חלקיתב יכול להיות מטוהרים יותר בטכניקה chromatographic משלימים, כגון חילוף יונים כרומטוגרפיה (IEX) או סינון / גודל ג'ל הרחקת כרומטוגרפיה ^9,10.

בגלל ספיגת אור ייחודי ומאפיינים פליטה, פרופיל elution של ה-GFP ניתן לזהות שימוש ב-line ופוסט להפעיל גישות. לשם כך, פרוטוקול זה יכול עוד להיות מותאם לטיהור של ה-GFP-Fusion חלבונים רקומביננטיים, שבו חלבון המטרה קשור הוא "מסומן" עם ה-GFP. חלבונים היעד GFP-מתוייגים ניתן לאתר עם ​​האור האולטרה סגול ¹¹ ו מטוהרים באמצעות גישות chromatographic שונים, כולל אסטרטגיה טיהור היק שתואר לעיל. טיהור GFP הפך גם מצרך פדגוגית במעבדות ביוכימיה ללימוד טכניקות מודרניות מדע חלבון ^12.

בעוד חלבון בסיסי טיהור היק ניתן לבצע באמצעות החזקה משמעותית פחות כרומטוגרפיה סאיגזע, מכשור המוצג כאן יש מספר יתרונות ברורים על מנת לסייע בהשגת תוצאות חיוביות. היתרונות הבולטים של ניצול מערכת אוטומטית ביותר כוללים שיפור לרוץ אל הפעל מצב, שחזור זמן חיסכון, וירידה הזדמנויות אוויר שיש להזין למערכת ^10. מערכת מיזוג מבוקר חיץ, אשר בהנחייתם של Maximizer המערכת, מאפשרת עקביות מוגברת לקראת חיץ שחזור ניסיוני. ציור מטען מדגם מספיק לתוך לולאה דגימה דינמי לכל צופיות פועל עוד יותר מבטיחה אחידות המדגם להתווסף כל עמודה ומאפשר פועל ברצף ללא הפרעה או הוראות מחדש. הזרקה מדגם מבוקר מ לולאה דגימה על הטור מקטין שונות שעלולות להתרחש עם טעינת מדגם ידני. זוג שסתומים הבחירה עמודה לאפשר פועל מדגם רצופים, כל אחד באמצעות עמודת היק אחר, מבלי replumb המערכת. ביצוע מול TI גל ניתוח מועילה במיוחד כאשר מנסה לאמוד חלבון עם פרופיל spectrophotometric ייחודי. בנוסף ה-GFP, cytochromes, flavoproteins, ושאר heme המכיל חלבונים עשויים להפיק תועלת טכניקה זו. מוליכות ו-pH מערכות התראה לאפשר אימות בזמן אמת תנאי הניסוי. חלק פיצול אוסף eluate מאפשר טיפול חלק משופרת המאפשרת העברה קלה לאחר להפעיל שיטות ניתוח הדורשים נפח דגימה מינימלית (למשל ELISA, SDS-PAGE, המערבי כתם, ו אלקטרופורזה Experion microfluidic). בזמן ההפעלה מחובר 2 אספן חלק דורש סנכרון ידני, היא מאפשרת גמישות מרבית בבחירת אספן חלק. החסרונות המשמעותיים ביותר תוך ניצול מערכת כזו כרומטוגרפיה חזקים עבור עמודה היק צופיות וטיהור חלבון כולל את פרק הזמן הראשוני ההוצאות התקציביות הכרוכות ברכישת מכשיר והכשרה של המפעיל.

t "> פרוטוקול שהוצג מנצל מערכת ביו רד DuoFlow כרומטוגרפיה,. עם זאת, מכשור חזקים באותה מידה של יצרנים אחרים, כגון Avant אקטע מ GE Healthcare, עשוי גם להיות מנוצל ולא מסוגלים לייצר תוצאות מקבילות כרומטוגרפיה דומה גם במערכת יש מאפיינים ייחודיים (כגון: תכנות, מגבלות שיטת המינוח רכיב, עדיפות למפעיל, ויכולת הרחבה) כי יש לשקול לפני ביצוע הליך טיהור או רכישת מכשיר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (לא חובה)
DuoFlow ביולוגיים Pathfinder 20 מערכת	ביו רד	7602257	כולל מערכת Maximizer, מיקסר, תחנת עבודה F10, AVR7-3 שסתום, UV QuadTec / גלאי פנים, עם תא זרימה, אספן חלק BioFrac, תוכנה ביולוגיים, וערכת המתנע
AVR9-8 זרם בחר שסתום	ביו רד	7600408	שסתום לחץ גבוה, 9 יציאות, 8 מצבים, 3,500 psi (233 בר) על התחום, לשימוש עם מערכת DuoFlow ביולוגיים
Diverter שסתום SV3T-2	ביו רד	7600410	שסתום סולנואיד, 3 יציאות, 2 מצבים, 30 PSI (2 בר) על התחום, לשימוש עם מערכת DuoFlow ביולוגיים
הנחל מפצל שסתום	ביו רד
tical = LSR & parentCategoryGUID = 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba "target =" _blank "> DynaLoop 25 Kit	ביו רד	7500451	הזזה בוכנה לולאה ערכת דגימה, כולל 25 מ"ל DynaLoop הזזה לולאה בוכנה, DynaLoop ערכת חלקים (# 750-0450)
שבר BioFrac הנציב	ביו רד	7410002	חלק שני col המשפחה של לקטור שימוש
BioFrac ראש microplate ירידה במתאם	ביו רד	7410088
BioFrac microtiter מתאם צלחת	ביו רד	& = מדינה בארה"ב & lang = he & ProductID = 741-0017 "target =" _blank "> 7410017
UV אופטיקה מודול	ביו רד	7500202
מנורת הלוגן	ביו רד	< target = "_blank"> 7601331
Econo משאבת Gradient	ביו רד	7319001	משאבת שיפוע לטיהור בלחץ נמוך חלבון, כולל צינורות ערכת אביזרי
Experion מערכת	ביו רד	bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad? cmd = BRCatgProductDetail & ProductID = 224301 "target =" _blank "> 7007001
Experion Pro260 ערכת ניתוח	ביו רד	7007102
טור היק HiTrap בחירת ערכת	GE Healthcare	28-4110-07	כולל 7 x 1 מ"ל מראש ארז עמודי התקשורת היק עבור צופיות
GE Healthcare אל ביו רד אביזרי עמודה	GE Healthcare	18111251 ו 18111257