Автоматизированная гидрофобные взаимодействия хроматографии на колонке выбора для использования в очистки белков

Резюме

Автоматизированный метод определения подходящей гидрофобные взаимодействия хроматографии (МКХ) средства массовой информации, которые будут использоваться в процессе очистки белков представлен. Метод использует среднего давления жидкостной хроматографии в том числе автоматизированные системы смешивания буфера динамической впрыск топлива образца, последовательный выбор колонки, многоволновых анализа и разделения долей элюата коллекции.

Аннотация

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or "scouting") in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein ¹. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.

HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH₄)₂SO₄). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) ². As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter ³. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs ⁴.

The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light ⁵. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

протокол

1. Буфера и подготовки проб

1. Техническое примечание: Все буферы должны храниться в холодильнике, и каждый шаг в этом протоколе должны быть выполнены на льду или при температуре 4 ° C, если не указано иное. Низкая температура необходима для предотвращения деградации белка, чтобы очиститься и обеспечить оптимальные условия эксплуатации. МКХ средства массовой информации может привести к разным результатам, если отделение работает при комнатной температуре, и хроматографии Система должна работать в 4 окна ° C холодном помещении или холодно.
2. Подготовить 500 мл следующие буферы: 200 мм NaH ₂ PO ₄ (буфер A1), 200 мМ Na ₂ HPO _4, (буфера A2), и 4,8 М (NH _{4) 2} SO ₄ (Buffer B2). Деионизированная вода (Buffer B1) также будет использоваться. Дега буфера для обеспечения оптимальной хроматографических условий эксплуатации. Система максимайзер смешаются вместе буфера A1 и A2, чтобы создать с низким содержанием соли фосфата элюирующего буфера, и она будет сочетаться буферов B1 и B2для получения высокой соли сульфат аммония начала буфера (2,4 М (NH _{4) 2} SO _4).
3. Подготовить 20 мл образца должны быть загружены, смешивая 10 мл Клеточный лизат содержащие белок быть очищены с 10 мл буфера B2. Конечная концентрация сульфата аммония в растворе образца лизат клетка должна быть около 2,4 М (NH _{4) 2} SO _4, что делает его примерно соответствует началу буфера. Сотовые лизат может быть получен путем суспендирования бактериальный осадок клеток в ТЕ буфера (10 мМ Трис 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), а затем с помощью ультразвука или добавлением 1 мг / мл лизоцима и центрифугированием при 3700 × г в течение 10 минут.
4. Фильтр лизат-буфера смесь через низкий связывания с белками 0,45 мкм шприц фильтр для удаления твердых частиц из раствора. Храните образцы на льду, пока не готов быть загружены в систему.

2. Физическая установка и Сантехника Системы DuoFlow хроматографии

1. Убедитесь, что все устройства электропередачи и связи соединений. Устройства должны быть видны в биологических DuoFlow хроматографии окна программы ручного управления. Краткое описание устройства приведены в таблице 1. Иллюстрация системы и сантехника диаграммы на рисунке 2.
2. Присоединить электрические соединения для клапанов насоса станции и системы максимайзер порты, такие, что порт Нумерация соответствует логической последовательности. На каждом клапан с соответствующим номером порта для дальнейшего использования. Рабочая станция насоса и системы максимайзер служить в качестве основного соединения связи между компьютером / контроллером и хроматографии системы. Клапаны будут автоматически распознаются и отображаются в программном обеспечении при подключении или устройства.
3. Техническое примечание: При работе хроматографии системы в ручном режиме, клапаны управляются независимо друг от друга. Позаботьтесь, чтобы убедиться, что требуемый расход путь настроен, особенно при переключении клапанов, перед началом любительэ потока.
4. Погрузитесь тефлоновой трубки в буфер A1, A2, B1 и В2. Обеспечение адекватного объема буфера доступны для весь протокол и что трубы будут оставаться под водой. Подготовка 500 мл буфера A1, A2, B2 и 1 л буфера B1 будет адекватным.
5. Plumb пример загрузки клапан и динамического цикла образца, как показано на рисунке 2 и в соответствии с инструкциями производителя. Подключите пример цикла на входе образца клапан (позиция 3), используя наименьшую длину труб возможно. Это сведет к минимуму разведения образцов в процессе загрузки образца.
6. Свернуть трубку длиной от образца, образец насоса загрузки и загрузки образцов впускной клапан (позиция 2). Это позволит уменьшить количество образцов необходимо загрузить образец цикла.
7. Подготовить 8 одинаковых по размеру пар 1/16 "трубы диаметром PEEK, с каждой пары соединенных друг с другом 1/4-28 female-to-1/4-28 женский союз. Подключите пар Позиции 1-8 из двух столбцов Выбор клапанов. 7 союзныхс связаны в линии выбора столбца клапан Позиции 2-8 в дальнейшем будут заменены хроматографические колонки для тестирования. Объединение связано с встроенным позиция 1 будет поддерживаться в обход колоночной хроматографии.
8. Техническое примечание: Убедитесь, каждая пара трубка подключена к той же позиции на оба клапана столбца.
9. Включите оба 4-волны UV / Vis детектор (QuadTec) лампы и фиксированной длиной волны 280 нм, УФ-лампы детектора. Длин волн измеряется QuadTec этого протокола включает 214 нм, 280 нм и 397 нм. Измерение 280 нм и с фиксированной длиной волны детектора ультрафиолетового и QuadTec обеспечивает резервирование системы и гарантирует, что данные действия.
10. Подтвердите все датчики откалиброваны в соответствии с инструкциями производителя. Регулятор противодавления необходимо уменьшить накопление пузырьков воздуха в детекторах и должен быть установлен ниже по течению от детекторов, но вверх по течению рН монитора.
11. Системы, представленные здесь включает в себя два fractioн коллекционеров, который обеспечивает существенное удобство для последующей перспективе элюата анализа. Прикрепите часть коллектора, поток сплиттер клапан и контроллер сплиттер, как показано на рисунке 2. Доля коллектор подключен к Поместите 1 клапан сплиттер будет собирать 900 мкл фракций элюата в 12 пробирок мл культуры, в то время как доля коллектор подключен к Позиция 2 будет собирать 100 мкл фракций элюата в 96 луночных микротитровальных.
12. Позиция 2 часть коллектора, сплиттер клапан, и сплиттер контроллер работает автономно от хроматографии станции. Контроллер сплиттера, содержащихся в Bio-Rad насоса Econo Gradient, однако, насос компонент устройство не используется. "% Сплит" вариант настройки будут отображаться на насосы Gradient Econo когда клапан сплиттера подключен к нему.
13. Установить% Сплит 10. Позиция 1 часть мусора будет собирать 90% элюата (900 мкл / долей), а позиция 2 часть мусора будет собирать10% (100 мкл / фракция). Фракция коллекционеров будет продвигать в синхронии позволяет доли числа и коллекторов соответствуют друг другу.
14. Замените стандартные часть коллектора падение головой Позиция 2 часть коллектора с головой падение планшета. Глава планшет капля имеет диафрагму, которая позволяет сбор в размере 50% меньше, падение размеров (т.е. 25 мкл вместо стандартных 50 мкл) и особенно полезны при сборе ≤ 500 мкл фракции.
15. Работа с экранной панели управления, установить Позиция 2 часть коллектор для сбора фракций в 96-луночных планшетах и ​​продвижение в размере 1 образец / мин. Контроллер сплиттер и позиция 2 часть коллектора будет запущен вручную сразу же после начала первого запуска хроматографии.
16. Флеш Позиция 2 коллектор фракций и главы планшет падение с буфером B1.

3. Грунтовка системы линий, программирование Run метод и EquilibratING МКХ Столбцы

1. С системой линий максимайзер входе погружен в дегазированной буфера A1, A2, B1, B2, премьер-станции насосы, промыть образец цикл, и промойте хроматографии системы в соответствии с инструкциями производителя. Полный шаг грунтовка со всеми 4 входа максимайзер системы (A1, A2, B1 и B2), чтобы удалить оставшиеся пузырьки воздуха.
2. Подготовка системы требует ручной работы системы управления через биологические программного обеспечения. Подтверждение правильности позиционирования образца клапана нагрузки и клапаны выбора столбца до начала буфера потока.
3. Подготовить для начала эксплуатации 1 мл / мин Поток элюирующего буфера (0% B) в рамках системы, как описано в шагах 3.4-3.5.
4. В окне установки программного обеспечения BioLogic, выберите "Использовать буфер наложения" и "фосфатного буфера сульфатом аммония". Подтвердите буферов A1, A2, B1 и B2, перечисленные в окне настройки соответствуют тем, которые подготовлены.
5. Ручная установка скорости потока 1 мл / мин элюирования буфер(0% В). Соблюдайте противодавление, проводимости, УФ-обводка, и рН остаются неизменными и в пределах нормы эксплуатации. Нарушения показывают воздуха или столбце блокировки, которые должны быть рассмотрены до начала разбирательства.
6. Сбросить все 8 линий выбора столбца с 5 мл буфера элюирования. Для этого сначала остановить поток, установка арматуры и выбора столбца в положение 2, а также возобновления 1 мл / мин поток, 0% B. Повторите эти действия для выбора столбца линии в позиции 3-8.
7. Подключите 1 мл колонны HiTrap HIC на позиции 2-8 клапанов столбца. Выполните шаги 3.8-3.13 с одной колонки на время. Принять к сведению которого HIC колонка находится в каком положении выбора клапана. Резюме МКХ колонка СМИ характеристик приведены в таблице 2.
8. Физического соединения колонн GE Healthcare HiTrap на Bio-Rad системы DuoFlow требует ряда арматуры использования 1/4-28, M6, и Luer арматуры. Удалите союз подключения Позиция 2 клапанами столбца.lign Bio-Rad и GE Healthcare арматуры как показано на рисунке 3.
9. Прикрепить вверх арматура колонке DuoFlow. Избежать захвата пузырьков воздуха в колонне или НКТ, твердо крепления вверх арматура колонки вверх установка клапана отбора. Запуск элюирующего буфера через фитинги, пока все воздух выбрасывается и большой каплю буфера присутствует. Временно прекратить буфер потока.
10. Снимите пробку подключен к колонке входе и капните каплю с низким содержанием соли буфера (0% B) в верхней части колонны. Прикрепите колонку к вышестоящему арматуры. Наличие обеих входе колонны и входной патрубок переполнены капли буфера обеспечивает подключение бесплатно пузырьков воздуха.
11. Если столбец используется в первый раз, обрывать конце выходе из колонки. Прикрепите выход на колонки вниз арматура и трубы выбор клапана. Проверьте все соединения плотно закреплены.
12. Установить предельный противодавление до 40 бар. Промойте колонку со5-й колонке объемов (5 томов колонки = 5 мл) элюирующего буфера (0% B) при скорости потока 1 мл / мин. Продолжить колонке мыть, при необходимости, до рН, УФ обводка и противодавление стабилизировались.
13. Промойте колонку 10 колонки объема (10 мл) начала буфера (100% B) при скорости потока 1 мл / мин. Продолжить колонке мыть, при необходимости, пока система параметров, перечисленных в предыдущем пункте, а также проводимости стабилизировались.
14. МКХ колонка подготовлена ​​выше готов к загрузке образца. После того как все столбцы, которые будут протестированы готовы, ручного переключения клапанов выбора столбца в положение 1 (союз) и остановить поток буфера.

4. Пример Загрузка

1. Погрузитесь образца входе трубы в 20 мл образца, чтобы начать процесс загрузки образца в динамическом цикла образца. С ручной окно настройки BioLogic программного обеспечения, переключение нагрузки образец цикл / мыть клапан в положение 1 (Sample) и образец загрузки клапан продувки.
2. Начало действияЗагрузка образцов цикла насоса, составление образца в насос трубы при скорости потока 1 мл / мин до сразу после образца достигает клапана загрузки образцов. Это устраняет буфера и / или воздуха от линии нагрузки образца.
3. Остановить поток грузового насоса и клапана переключения нагрузки с образца чистки для загрузки. Перезапустить загрузку образца цикл насоса при скорости потока 1 мл / мин до 10 мл образец был разработан в динамический цикл образца.
4. Достаточно образца теперь загружаются в динамическую цикла образца в течение 10 последовательных МКХ колонке разведку трассы.

5. Программирование Программное обеспечение метода и запуск Колонка Скаутинг протокола

1. От установки окна на BioLogic программного обеспечения, выберите систему устройств, отмеченные звездочкой в таблице 1.
2. Выберите 6 HIC столбцов анализа. Программа линейного нисходящего градиента соли и 6 колонками разведки метод, как показано в таблице 3. Метод программа modificatионов BioLogic программного обеспечения HIC установку колонки и был оптимизирован для текущего приложения.
3. 6-колонки разведки метод рекомендуется из-за ограничений доля мусора. Все 7 колонок можно разведку, если программа корректируется методом для сбора большего объема фракции. Не добавляйте разведки шаг, пока в остальном программа полная, как выбор разведки функция предотвращает последующее редактирование.
4. Начало разведки перспективе. Вручную начать начало буфера (100% B) потока 1 мл / мин. Нажмите Пуск на контроллере сплиттер начаться 90% -10% элюата поток расщепления между 12 мл пробирку часть коллектора (позиция 1) и 96-луночного планшета часть коллектора (позиция 2), соответственно. Техническое примечание: Напомним, 96-луночного планшета часть коллектора работает автономно от BioLogic программного обеспечения.
5. Запустите программу методом. Сразу же после начала запуска программы метод, нажмите кнопку Пуск на экране панели управления автономного 96-луночного планшета fractioя коллекционер. Если два коллекционеров фракция не на 100% синхронной вручную продвижения форума 96-луночного планшета часть коллектора, как другая часть коллектора авансы второй пробирки фракции.
6. Соблюдайте отображения реального времени для подтверждения ожидаемых параметрах запуска. Противодавление, проводимость, и% B (рис. 4) выполняются параметры, которые могут быть проверены, чтобы гарантировать колонки к колонке воспроизводимости выполнения условий. Клапан позиционирования, рН и загрузки образца должны быть проверены. УФ начертания можно сравнить с аналогичной проверки проточной элюции пика.
7. Использование в линию и после выполнения методов элюата анализ, чтобы определить профиль элюирования и очистки белков интерес (например, "белка-мишени").
8. Для образцов, содержащих GFP, соблюдать элюирования в линию с использованием уникальных поглощение УФ-белка при 397 нм. Сравните GFP конкретных поглощения 397 нм для отслеживания общего белка 280 нм поглощение отслеживания оценить относительное расстояниеи очистки с использованием различных средств массовой информации МКХ быть разведку (рис. 5).
9. После выполнения анализа GFP и других белков, цель может быть достигнута через несколько методов. Аликвоты мкл 5-50 из 96-и фракций пластины могут быть перенесены на новую пластину и анализировали на конкретное содержание белка методом ИФА и Вестерн-блот, а общее содержание белка в каждой фракции может быть проанализирован с помощью обычных SDS-PAGE или Experion микрофлюидных электрофорез системы. GFP флуоресценции можно обнаружить в 12 мл культуры труб с использованием ультрафиолетового излучения (рис. 6).
10. Определение наиболее перспективных МКХ средства массовой информации может быть определена путем сравнения GFP элюирования относительно других белков, содержащихся в образце. Очистка с наиболее перспективными МКХ средства массовой информации может быть оптимизирован в соответствии с другими параметрами, в том числе типа и концентрации буфера начала и рН.
11. Техническое примечание: В конце эксперимента, поместите все входной строки в буфер B1 (дегазацииH ₂ O) и тщательно промыть насосы, клапаны, и все трубы с водой. Следуйте инструкциям производителя для очистки и длительного хранения системы хроматографии и МКХ столбцов.

6. Представитель Результаты:

Представитель МКХ соли градиент, проводимость, а в колонке давление разведку трасс представлена ​​на рисунке 4. Изменение концентрации соли (синяя линия), измеренный по доле буфер обращается с высоким уровнем соли линии буфера является типичным МКХ методологии. Поскольку концентрация солей уменьшается, белки, которые связываются с колонкой элюируются. Проводимости (красная линия), что соответствует наблюдается концентрация соли, измеряется в линии сразу после QuadTec и УФ-детекторы. Вне установить градиент между солью и проводимости обводка указывает на время, необходимое для буфера путешествовать из буфера на входе, через систему, и проводимость монитора. На протяжении образца перспективе, тОн давления в системе (серые линии) и рН остаются относительно постоянными.

На рисунке 5 показаны хроматограммы последовательных МКХ колонке разведку трассы. В линию обнаружения общего белка _(280, синяя линия) и GFP _(397, зеленая линия) осуществляется путем измерения поглощения света при 280 нм и 397 нм соответственно. Вполне возможно, приблизиться к относительной численности GFP с отделением для каждого разведки перспективе путем сравнения двух строк. GFP связан с проверенной МКХ столбцы с различной степенью сродства и его профиль элюирования разнообразны. Выбор предпочтительной МКХ колонки для будущего очищения основан на определении столбца, который производит самый острый пик элюирования GFP и самый большой отрыв от других белков.

На рисунке 6, культуры труб для фракции 10, 12, 14, 16 и 18 Фенил FF (высокий суб) разведку перспективе были визуализированы при комнатной окружающей среды (флуоресцентные) света и ультра(УФ) светом. Трубы были рассматриваться как лицо вперед (левая панель) и сверху вниз (правая панель) для того, чтобы наблюдать характерный спектр излучения GFP. GFP (зеленый) четко обнаружить во фракции 14 и УФ-изображения. Это сообщение перспективе данные соответствуют приятно с на линии обнаружения GFP, измеряя поглощение элюата при 397 нм _(397, зеленая линия), который также определяет доля 14, содержащий основные пик элюированных GFP. Диффузный синий в левой панели УФ света, излучаемого УФ-лампы.

Рисунок 1. Схематическое изображение этого протокола. Бактериальный лизат содержащие белок (GFP, белка-мишени) получают, разбавляют в высокой соли буфер эквивалент в буфер начало хроматографии, и фильтруют. Как только система жидкостного хроматография готова, образец загружается и целевого белка отделяется от других белков, содержащихся яп лизат использованием гидрофобного среднего хроматографии, содержащихся в расфасованных МКХ колонке. Метод разделения повторяется несколько раз, используя различные средства массовой информации хроматографии (именуемые колонке разведка), с тем чтобы определить, какие средства массовой информации обеспечивает лучшее разделение GFP. Элюированных белков (элюата) анализируется в линию с помощью детекторов, включенных в хроматограф и собирается на более мелкие фракции для последующего (после работы) анализа. На основании в линию и после выполнения анализа деятельности GFP и разделения, оптимальный МКХ колонки и хроматографического среды определены.

Таблица 1. Основные хроматографии компоненты системы, используемые в настоящем протоколе.

Рисунок 2. Схема Bio-Rad DuoFlow среднего давления жидкостной хроматографии используемой системы. Ключевые особенности сиостановить включают автоматизированное смешивание буфера, загрузка выборки для последовательных работает колонка, автоматизированный выбор различных хроматографических колонок, в оперативный анализ элюата, и тандем коллекции фракционированного элюата. См. текст и таблицу 1 для подробностей.

Таблица 2. Биофизические характеристики МКХ СМИ испытания. Имя столбца МКХ HiTrap указывает на лиганд, лиганд плотность и размер гранул.

* FF = быстрый поток, HP = высокая производительность. Большие размер гранул увеличивается связывание лигандов мощности и скорости потока. Меньший размер гранул увеличивается хроматографического разрешения. Информация, полученная от литературы, предоставленной производителем.

Рисунок 3. Подключение GE Healthcare HiTrap МКХ колонки Bio-Rad DuoFlow system.To вверх 1/4-28 гайки Delrinой наконечник (A1), мужской Luer к женщине 1/4-28 установки (B1) и мужской 1/16 "к женщине установки Luer (C) связаны между собой. фитинги крепятся к HiTrap колонке после того, как промыть буфера и имеющие все пузырьки удалены. выходе из колонки связана с женским 1/16 "к наружной резьбой М6 (D), мужской Luer-женщинам M6 соединения (E), и женские Luer к женщине 1 / 4-28 установки (B _2). Вся эта сборка подключена к течению 1/4-28 гайки Delrin и наконечником _(2). На верхней панели отображается фитинги разделяют и нижнюю панель показывает арматура в сборе.

Шаг #	Объем (мл)	Описание	Параметры
1	0,00	Соберите 1,0 мл фракции во время всего тиража
2	0,00	Свитч. Столбцы	МКХ Колонка 1 (Позиция 2)
3	0,00	Изократическом потока	рН: 6.80 100% B	Объем: 2,00 мл Расход: 1,00 мл / мин
4	2,00	Нулевой базовой	QuadTec
5	2,00	Нулевой базовой	УФ-детектор
6	2,00	Вводите образца	Пример нагрузки Динамические Loop	Auto Вводите клапан Объем: 0,50 мл Расход: 1,00 мл / мин
7	3,00	Изократическом потока	рН: 6.80 100% B	Объем: 5.00 мл Расход: 1,00 мл / мин
8	8,00	Линейный градиент	рН: 6.80 100% B -> 0% B	Объем: 10.00 мл Расход: 1,00 мл/ Мин
9	18,00	Изократическом потока	рН: 6.80 0% B	Объем: 3,00 мл Расход: 1,00 мл / мин
10	21,00	Изократическом потока	рН: 6.80 100% B	Объем: 5.00 мл Расход: 1,00 мл / мин
11	26,00	Поменять местами столбцы	Союз (Позиция 1)
Конец	26,00	Конец протокола	Автоматически повторяется с 5 дополнительных столбцов HIC (Позиции 3-7)
Скаут типа		Количество трасс: 6	Число шагов разведку: 1

Таблица 3. BioLogic программное обеспечение протокола МКХ разведки применяемого метода.

Рисунок 4. Представитель соль МКХ градиента проводимости, а в колонке давление. Поскольку концентрация солей (синяя линия) уменьшается, проводимость (красная линия) делает также. От набора градиент между солью и проводимости обводка указывается время, необходимое для буфера путешествовать из буфера входной проводимости монитора. Давление в системе (серые линии) остается относительно постоянным в течение всего срока разведки перспективе.

Рисунок 5. Составлено хроматограмм последовательных колонки МКХ HiTrap разведку трассы. В линию обнаружения общего белка _(280, синяя линия) и GFP _(397, зеленая линия) осуществляется путем измерения поглощения света при 280 нм и 397 нм соответственно. В этой серии экспериментов, острый пик элюирования GFP наблюдали с Фенил FF (высокий суб) сolumn. Фенил FF (высокий суб) также появилась колонка обеспечить наибольшую расстояние между GFP и других белков. Дополнительный 1 мл HiTrap МКХ колонны испытания включены фенил быстрый поток низкого замещения (фенил FF (низкий суб)), бутил быстрый поток (бутиловый FF), бутил-S быстрый поток (бутил-S FF) и быстрый поток октил (октил FF) .

Рисунок 6. Представитель после выполнения визуализации GFP в образце элюата. Элюата фракций были собраны в размере 1/minute, и каждая была проанализирована на содержание GFP. При этом представитель фигура, культуры труб для фракции 10, 12, 14, 16 и 18 Фенил FF (высокий суб) разведку перспективе были визуализированы в окружающем номер (флуоресцентные) света и ультрафиолетовых (УФ). Трубы были рассматриваться как лицо вперед (левая панель) и сверху вниз (правая панель). Диффузный синий в левой панели УФ света, излучаемого УФ-лампы. GFP (зеленый) четко обнаруживается в ГРПТион 14 и УФ-изображения. На верхней панели указывает на общий белок (A280, синяя линия) и GFP _(397, зеленая линия) хроматограмме начертаний 5 фракций быть визуализированы.

Обсуждение

Жидкие методы хроматографии являются неоценимым для подготовки высоко очищенных белков, необходимых для проведения иммунологического ^6, биохимические ^{7, 8} и структурных исследований. МКХ методы очистки чаще всего требуют эмпирического определения предпочтительной средой, и лиганд структуры, плотности лиганда, а матрица шарик свойства все было показано, что влияние результатов хроматографического ^{2, 3.} Автоматизированная колонке разведки является эффективным подходом к выбору МКХ средой для последующей оптимизации и очистки белков ^4. Автоматизированный метод разведки колонке представлены может быть легко адаптирована к различным МКХ стратегии очистки белков. Изменения в концентрации солей, выбор соль, соль градиент рН и может еще улучшить условия очистки, а также влияние изменения этих основных параметров были ранее рассмотренных ^13,14. МКХ элюата содержащую частично очищенный целевой proteВ дальнейшем можно очищают, используя дополнительный метод хроматографического, таких как ионообменной хроматографии (IEX) или гель-фильтрации / размер хроматографии ^9,10.

Благодаря своей уникальной поглощения света и эмиссионные характеристики, профиль элюирования GFP можно получить, используя в линию и после выполнения подхода. В связи с этим, этот протокол может быть дополнительно адаптирована для очистки рекомбинантного GFP-гибридных белков, в которых не связаны белка-мишени в «меченых» с GFP. GFP-меченных белков цели могут быть обнаружены с помощью ультрафиолетового излучения ¹¹ и очищенной с помощью различных хроматографических подходов, в том числе МКХ стратегии очистки, описанной выше. GFP очистки также стала основной в педагогической лаборатории биохимии для обучения современным методам научных белка ^12.

В то время как основные МКХ очистки белков могут быть проведены с использованием значительно менее надежные хроматографии систвола, приборы, представленные здесь имеет ряд явных преимуществ, чтобы помочь в получении положительных результатов. Заметные преимущества использования высоко автоматизированные системы включают улучшение запуска к запуску условиях воспроизводимости, экономия времени и снижение возможностей для воздуха должно быть введено в систему ^10. Система контролируемого буфер смешивания, которая способствовала система максимайзер, позволяет увеличить последовательности в подготовке буфера и экспериментальной воспроизводимости. Опираясь достаточно нагрузки образца в динамическом цикле образец для всех разведку работает также обеспечивает однородность образца добавляется в каждом столбце и позволяет последовательное работает без перерывов или ручной перезарядки. Контролируемые инъекции образец из выборки цикла на колонку уменьшается изменчивость, которые могут произойти с ручной загрузкой образца. Пара клапанов выбора столбца позволяют последовательно работает образца, каждый из которых использует различные МКХ колонке, без replumb системы. Выполнение мно Ti-волны анализ особенно полезен при анализом белков с уникальной спектрофотометрического профиля. В дополнение к GFP, цитохромов, флавопротеидов и других гем-содержащих белков могут получить выгоду от этой техники. Устройства проводимости и рН мониторинга позволяет для проверки в реальном времени экспериментальных условиях. Сплит часть элюата коллекция позволяет улучшить обработку фракции и позволяет легко переносить на пост перспективе методы анализа, которые требуют минимального объема выборки (например, ИФА, SDS-PAGE, Вестерн-блот и Experion микрофлюидных электрофорез). При работе второго форума коллектор фракция требует ручной синхронизации, что позволяет обеспечить максимальную гибкость в выборе часть коллектора. Наиболее значительные недостатки использования таких надежная система хроматографии для МКХ колонке разведки и очистки белков включает в начальный момент времени и бюджетных расходов, связанных с приобретением инструмента и обучения операторов.

т "> протокол, представленные здесь используется Bio-Rad DuoFlow хроматографии системе. Однако, в равной степени надежными приборами других производителей, таких как Avant Акта от GE Healthcare, могут быть также использованы и способны производить эквивалентные результаты даже сопоставимого хроматограф обладают уникальными характеристиками (например, метод программирования, компонент номенклатуры, оператор предпочтения и масштабируемость ограничений), которые должны быть рассмотрены до начала процедуры очистки или инструмент приобретения.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (опционально)
BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 системы	Bio-Rad	7602257	Включает в себя системы максимайзер, миксер, F10 станции, AVR7-3 клапана, QuadTec UV / Vis детектор с проточной ячейки, BioFrac коллектора фракции, BioLogic программного обеспечения, а стартовый комплект
AVR9-8 потоковых выбрать клапан	Bio-Rad	7600408	Высокого давления клапан, 9-порт, 8-позиционный, 3500 фунтов на квадратный дюйм (233 бар), предел, для использования с биологической системы DuoFlow
Переключающий клапан SV3T-2	Bio-Rad	7600410	Электромагнитный клапан, 3-порт, 2-позиционный, 30 фунтов на квадратный дюйм (2 бар) предел, для использования с биологической системы DuoFlow
Поток сплиттер клапан	Bio-Rad
ских = ЛСР и parentCategoryGUID = 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba "целевых =" _blank "> DynaLoop 25 Kit	Bio-Rad	7500451	Шкафы-поршневой комплект образцов цикл, включает в себя 25 мл DynaLoop скольжение поршня цикл, DynaLoop части комплекта (# 750-0450)
BioFrac коллектора доля	Bio-Rad	7410002	Два часть коллег преподаватели использовали
BioFrac планшет падение головы адаптера	Bio-Rad	7410088
BioFrac планшет адаптер	Bio-Rad	И страна = США и LANG = EN & ProductID = 741-0017 "целевых =" _blank "> 7410017
УФ оптики Модуль	Bio-Rad	7500202
Галогенные лампы	Bio-Rad	< целевых = "_blank"> 7601331
Econo Gradient насоса	Bio-Rad	7319001	градиент насос низкого давления, очистки белков, включает в себя трубы и фитинги комплект
Система Experion	Bio-Rad	bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad? Cmd = BRCatgProductDetail & ProductID = 224 301 "целевых =" _blank "> 7007001
Experion Pro260 Анализ Kit	Bio-Rad	7007102
HiTrap МКХ комплект выбора колонки	GE Healthcare	28-4110-07	Включает в себя 7 х 1 мл расфасованных колонны МКХ средств массовой информации для разведки
GE Healthcare к Bio-Rad арматура колонка	GE Healthcare	18111251 18111257 и