Basophil מבחן הפעלה לחקירות IgE בתיווך מנגנונים של תרופות רגישות יתר

Summary

מבחן Basophil ההפעלה הוא כלי רב עוצמה לצורך זיהוי של IgE תלויי אלרגיות במבחנה. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה עבור מבחן ההפעלה basophil משמש לחקור רגישות יתר בסמים. שיטה לייצור יעיל של סמים חלבון conjugates קוולנטיים ואפיון physicochemical שלהם מתואר.

Abstract

תגובות רגישות יתר כנגד סטרואידיות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) כמו propyphenazone (PP) ו - diclofenac (DF) יכול להתבטא סוג אני כמו תגובות אלרגיות ^1. בפועל קליני, אבחון של רגישות יתר בסמים מתבצע בעיקר על ידי ההיסטוריה המטופל, כמו בדיקות העור אינו אמין בדיקות פרובוקציה אוראלי דובים מסכני חיים סיכונים עבור ² המטופל. לפיכך, עדות pathomechanism IgE בתיווך הבסיסית קשה להשיג.

כאן, אנו מציגים שיטה חוץ גופית מבוסס על שימוש של בזופילים האדם הנגזרות סמים רגישות יתר המטופלים המחקה את התגובה האלרגית מפעיל in vivo. כפי בזופילים של סמים אלרגית חולים לשאת מולקולות IgE ספציפי לתרופה האשם, הם הופכים להיות מופעל על crosslinking קולטן IgE ולשחרר מולקולות מפעיל אלרגית. הפעלה של בזופילים יכול להיות פיקוח על ידי קביעת upregulation הביטוי CD63 פני השטח באמצעות זרימת cytometry ^3.

במקרה של תרופות נמוך משקל מולקולרי, conjugates נועדו לאפשר crosslinking IgE קולטן על בזופילים. כמתואר באיור 1, שני נציגים של NSAIDs, PP ו DF, מחויבים קוולנטית אל אלבומין בסרום אדם (HSA) באמצעות קבוצת carboxyl מגיבים עם קבוצת אמינו ראשונית של שאריות ליזין. DF נושאת קבוצה carboxyl מהותי, ולכן ניתן להשתמש ישירות ^4, בעוד קבוצה המכילים carboxyl נגזרת של PP חייב להיות מסונתז organochemically לפני המחקר ^1.

מידת הצימוד של תרכובות נמוך משקל מולקולרי על מולקולת חלבון המוביל הפריסה המרחבית שלהם חשוב להבטיח crosslinking של שתי מולקולות IgE הקולטן. פרוטוקול המתואר כאן חל כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים בגודל הרחקה (HPSEC) מצויד עם מקדם שבירה רציפים (RI) אולטרה סגול (UV) מערכת זיהוי לקביעת מידת צימוד.

כפי המתודולוגיה המתוארת ניתן להחיל על תרופות אחרות, המבחן ההפעלה basophil (BAT) נושא את פוטנציאל לשמש לקביעת IgE בתיווך מנגנונים רגישות יתר בסמים. כאן, אנו קובעים PP רגישות כמו בתיווך IgE ו רגישות יתר DF כלא IgE מתווכת על ידי BAT.

Protocol

1. הכנת conjugates סמים

1. להמיס 10 מ"ג DF ב 1 מ"ל DH ₂ O ב צינור 1.5 תגובה מ"ל. בהליך נוסף להשתמש 95 μl של פתרון זה DF. כדי המצומד PP כדי לפזר HSA 30.4 מ"ג נגזרות PP (304 g / mol) ב 500 μl הידרוקסיד M 0.3 נתרן (NaOH).
2. הוסף μl 430.6 DH ₂ O ו - 100 μl 0.5 מ '2 - (N-morpholino) ethanesulfonic חומצה (MES) pH חיץ 6.5-95 μl של DF מומס. הוסף μl 33.1 DH ₂ O ו - 140 μl של 2 M MES חיץ pH 2.9 המדגם PP.
3. הוסף μl של 57.5 שהוכן זה עתה N-ethyl-N "- (3-dimethylaminopropyl) hydrochloride carbodiimide (EDC) מניות פתרון מומס DH ₂ O עם ריכוז של 100 מ"ג / מ"ל מדגם DF, או 10 μl פתרון EDC אל המדגם PP. וורטקס דגימות דקה 1.
4. הוסף 16.9 μl של פתרון HSA עם ריכוז של 118 מ"ג / מ"ל ​​ל מדגם זה.
5. דגירה את הדגימות למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר תוך רועד ב 300 סיבובים / min.
6. Dialyze DF דגימות PP 3 פעמים נגד 2 ליטרים של בופר פוספט pH (PBS) מלוחים 7.4 במשך כמה שעות כל אחד. ביצוע כל הצעדים dialyzing ב 4 ° C.
7. צנטריפוגה מדגם 10 דקות XG 14,000 לאסוף את DF המכיל supernatant או PP מצומדות כדי HSA.
8. בדוק supernatant עבור חלבונים ידי ביצוע SDS-PAGE, באמצעות ג'לים 12%. עומס על 12 מיקרוגרם של HSA המצומד לתוך משבצת ריקה באחת ג'ל.

2. קביעת שיעור צימוד של conjugates התרופה (איור 2)

1. לניתוח של שיעור צימוד של DF ו PP conjugates ידי HPSEC להשתמש נתרן 100 mM פוספט pH 6.5 חיץ המכיל 150 mM NaCl ו אזיד הנתרן 0.05%. השתמש 7.8 x 300 מ"מ טפו-Gel-G2000 טור _SWXL.
2. בצע זיהוי של אותות באמצעות RI באינטרנט מצמידים ו גלאי מערכת UV.
3. הכן מדגם HSA סטנדרטי עם ריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ב DH ₂ O. עבור כיול גלאי להזריק 50 μl פתרון HSA סטנדרטי.
4. חשב את k קבוע RI _RI ואת _UV UV k קבוע הגלאי. השתמש בנוסחאות שטח = _{RI RI} k * [(dn / DC) _HSA * ג (HSA)] אזור _{UV UV} = k * [(DA / DC) _HSA * ג (HSA)] עם (dn / DC) = _HSA 0.185 ו (DA / DC) _HSA = 0.518 ^5.
5. הכן DF סטנדרטים PP נגזרת עבור HPSEC כי 5, 10 ו 30 nmol כמויות של סטנדרטים שניהם ניתן להזריק בקלות.
6. חישוב ממוצע ערכי (dn / DC) _סמים (DA / DC) _תרופה סטנדרטים שניהם. עבור DF, (dn / DC) של 0.235 ± 0.010 ו (DA / DC) של 39.000 ± 0.493 נקבע. עבור PP, (dn / DC) של 0.328 ± 0.016 ו (DA / DC) של 53.155 ± 2.464 נקבע.
7. Conjugates להזריק סמים על HPSEC ולקבוע RI שלהם באזורים שיא UV.
8. חשב את הריכוז של DF, נגזרת PP, ו HSA על ידי פתרון שתי המשוואות _{RI RI} = שטח k * [(dn / DC) _סמים * ג (תרופה) + (dn / DC) _HSA * ג (HSA)] _ו-UV שטח _UV = k * [(DA / DC) _סמים * ג (תרופה) + (DA / DC) _HSA * ג (HSA)] עבור נעלמים.

3. BAT conjugates שימוש בסמים

1. הכן seven cytometry צלוחיות זרימה תווית אותם, בהתאם לתוכן שלהם: שליטה בלא כתם, שליטה שלילית, שליטה חיובית, conjugates סמים.
2. פיפטה 50 μl של חיץ B-CCR-STB גירוי (Flow2 יצוק, Bühlmann מעבדות, Schönenbuch, CH) לתוך צלוחיות שמורות לשלוט בלא כתם ושליליים. כביקורת חיובית, להשתמש 50 μl של פתרון אנטי FcεRI המסופקים על ידי ערכת Flow2 יצוק. הוסף את הסכומים המתאימים לפתרון המצומד של צלוחיות שמורה conjugates התרופה על ידי יצירת סדרה דילול 1:10 מ -20 מיקרוגרם 0.02 / ml DF המצומד ו PP המצומד (ריכוז סופי בנפח assay של μl 200). ניסויים אלה טיטרציה יש לבצע כדי לקבוע את הריכוז של הפעלת basophil אופטימלית למדגם לכל מטופל.
3. הוסף 100 μl חיץ גירוי אל צינור כל EDTA 50 החולה μl הדם כולו. מערבבים את דגימות בזהירות.
4. פיפטה 20 מכתים μl Flow2 שחקנים מגיב המכיל נוגדנים נגד CCR3 שכותרתו עם phycoerythrin (PE) ואנטי CD63 נוגדנים שכותרתו עם isothiocyanate והעמסת (FITC) על צינור אחד ומערבבים שוב. אל פיפטה מגיב מכתים לתוך המדגם בלא כתם!
5. דגירה דגימות במשך 45 דקות בתוך אמבטיה במים 37 מעלות צלזיוס.
6. עצור תגובה על הקרח במשך 5 דקות.
7. Lyse אריתרוציטים ידי הוספת 2.0 מ"ל ריאגנט Flow2 שחקנים lysing אל הבקבוקון כל מערבולת בעדינות. דגירה דגימות בחושך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
8. צנטריפוגה דגימות במשך 5 דקות על XG 500 ו supernatant למזוג בזהירות.
9. Resuspend תאים 500 μl חיץ Flow2 שחקנים לשטוף ולאחסן על הקרח עד cytometry הזרימה.
10. התאם של מתח cytometer של זרימהettings עבור פיזור קדימה לוואי (FSC, SSC) בזמן רכישת מדגם בלא כתם.
11. שער התאים כצפוי לימפוציטים מתוך העלילה SSC-FSC אל חלקת SSC-PE. בזופילים מזוהים על ידי נוגדן אנטי CCR3 PE-שכותרתו CCR3 ^היי SSC ^והפלא השער אותם לתוך עלילה FITC-PE. נוגדן נגד CD63 גילוי בזופילים מופעל התווית FITC.
12. הגדר את חתוכים למקסימום 2.5% בזופילים כמו CD63 ^היי בבקרה שלילית. מדגם נחשבת חיובית עבור הפעלת basophil אם> בזופילים 5% הם CD63 ^היי ומדד הקרינה אומר (MFI) של המדגם מחולק MFI שליטה השלילית עולה על 2 (איור 3).

4. נציג תוצאות:

ניסוי זה מעריכה BAT ככלי מועיל לזהות IgE תלויי רגישות יתר בסמים. Conjugates חלבון של NSAIDs משמשים ההפעלה של בזופילים. עד HPSEC עם RI וזיהוי UV צבירה המדינה, תואר צימוד, ואת התשואה האפקטיבית של conjugates נקבעים. כמו איור 4 מראה, 43.5% מכלל conjugates DF נשאר monomeric עם תואר צימוד של 5.0 DF / HSA. עבור אגרגטים מידת צימוד של 9.5 נקבע. המצומד propyphenazone הוצגה מורכב מונומרים 68.5% עם תואר צימוד של 21.2. מידת הצימוד של אגרגטים היה 27.9. בסך הכל, מידת צימוד נחוש של conjugates DF היה 7.6 DF ושל conjugates PP היה 23.2.

BAT הופיע עם conjugates בתנאים אופטימיזציה (הריכוז של conjugates, זמן גירוי) אפשרה חקירה של IgE תלויי ותגובות רגישות יתר NSAID. כפי שניתן לראות בתרשים 5, רק המצומד PP מסוגל להפעיל הפעלה basophil דמיינו ידי upregulation בביטוי CD63 פני השטח: 20.6% של בזופילים הופעלו מאופיין Shift-יומן בעוצמת הקרינה. MFI גדל בפקטור של 4.9 מתוך 386 (בקרה שלילית) ל 1893. לעומת זאת, באמצעות המצומד DF רק 3.1% מכלל בזופילים הופעלו שהיה מתחת 5% חתוכים. גם MFI גדל רק פי 1.1 (גבול 2.0) מתוך 197 (בקרה שלילית) עד 210. תוקף Assay ניתנת על ידי (i) <הפעלה basophil 5% שליטה שלילי, (ii) log-שינוי עוצמת הקרינה של subpopulation basophil, וכן (iii)> בזופילים מופעל 50% (בקרה חיובית).

באיור 1. צימוד של נגזרות DF ו PP כדי HSA. לאחר המסת התרופות, המים, MES חיץ, ו EDC (מגיב צימוד) מתווספים. דגימות הן vortexed לרגע לפני 1 HSA הוא pipetted לפתרונות סמים. תוך 2 שעות בטמפרטורת החדר רעד התרופות להיקשר קוולנטית HSA. מונומרים כמו גם אגרגטים עלול לגרום.

איור 2. חישוב מעלות צימוד. ראשית, קבועים k _RI ו _UV k נחושים. לכן, HSA רגיל עם ריכוז ידוע מוזרק לתוך מערכת HPSEC. (Dn / DC) ו (DA / DC) של HSA מקבלים ערכים של 0.185 ו - 0.518, בהתאמה ^5. אזורים השיא משמשים לחישוב קבועים. שנית, לכל תרופה שלושה תקנים מוזרקים לקבוע סמים וריכוז ספציפי RI ושטחים UV. מאז _RI k _ו-UV קבועים k ידועים מן השלבים שלעיל, נגזרים התרופה הספציפית (dn / DC) ו (DA / DC) ניתן לחשב. שלישית, סמים HSA conjugates מוזרקים HPSEC. אזורי שיא וכתוצאה מכך משמשים כדי לחשב את ריכוזי התרופה HSA לכל שיא על ידי פתרון שתי משוואות עם שני משתנים בלתי ידועים.

איור 3. Gating Basophil. תאים כצפוי לימפוציטים הם מתפזרים בצד מגודרת לעומת פיזור קדימה (SSC-FSC העלילה). בזופילים מזוהים CCR3 ^היי SSC ^והנה מן לימפוציטים מגודרת (SSC-CCR3-PE העלילה). בזופילים הם ניתחו עבור הפעלה (CD63 ^היי) בעלילה CD63-FITC-CCR3-PE. בקרה שלילית משמש כדי להגדיר את חתך של בזופילים 2.5% לכל היותר שנותרו CD63 ^היי.

איור 4. מעלות צימוד נחושה של conjugates סמים. RI אותות UV להראות שתי פסגות המייצג אגרגטים (משחררי בווליום נמוך השמירה) ו מונומרים (משחררי בהיקף שימור גבוהה) של סמים HSA conjugates. אחוזי מונומרים אגרגטים (נקבע אותות RI) ותואר צימוד שלהם מתוארים (n = 1).

איור 5. Basophil activatiעל הבדיקה. תוצאות המצומד המופעל דגימות סמים, שולטת שלילי, חיובי שולטת מוצגים CD63-FITC-CCR3-PE חלקות (n = 1).

Discussion

BAT היא מבוססת היטב אף שעדיין לא בשימוש שגרתי שיטה לאבחון של מחלות אלרגיות בתיווך IgE ^6,7. עבור רגישות יתר בסמים, עם זאת, ישימותה נפגעת כמו תרכובות משקל מולקולרי נמוך אינם מסוגלים קולטנים crosslink IgE, תנאי מוקדם להפעלת basophil ^8. לכן, תרופות תחת חקירה צריך להיות יחד קוולנטית לחלבונים מנשא מתאים (למשל HSA). חשוב לציין, מידת צימוד (כלומר מספר של מולקולות התרופה לכל חלבון המוביל) צריך להיות בשליטה כדי להבטיח את פעילות מערכת החיסון (כלומר, הקולטן IgE cross-linking) של conjugates. באופן תיאורטי, שני haptens לכל מולקולה הספק צריך להיות מספיק עבור קולטן IgE cross-linking ומעטים כמו חמש מולקולות DF לכל HSA הוכחו ההדק לשחרר המתווך assay מבוססי תאים ^4. Conjugates שני, PP-HSA ו DF-HSA, נקבעו כדי להציג תואר צימוד גבוה מספיק (HPSEC) ולהיות פעיל immunologically שהופך אותם ריאגנטים מתאים לשימוש BAT. בעיה נוספת עשויה להיות כי מטבוליטים התרופה עשויה לשחק תפקיד, כמו המטבוליט במקום סמים ההורה עלול לגרום תגובת רגישות יתר. במקרה של DF, אפשרות זו נבדקה בהרחבה בעבר באמצעות five שלב חשוב אני מטבוליטים ואחד גרסה הצמדה ^4. גורמים חשובים עבור Mastering את הטכניקה המתוארת כוללים איכות דגימת דם (<12 שעות מאז איסוף דם, מספר בזופילים זוהה> 500) ואופטימיזציה של תנאים גירוי (מנה זמן). בנוסף, מה שנקרא לא מגיבים שאפילו לא מגיבים עם שליטה חיובית (נוגדנים כנגד הקולטן IgE) צריך להיות מזוהה. לכן, קריטריון האימות חייב לכלול נוגדן אנטי FcεRI כביקורת חיובית. יתרון חשוב של השימוש בסמים conjugates היא העובדה שהן מופיעות רעיל בניגוד סמים טהור, כפי שמוצג על ידי גירוי בשיתוף עם נוגדן אנטי FcεRI בבת ⁴ עבור DF-HSA המצומד. Pure DF, לעומת זאת, מציגה השפעות ציטוטוקסיות בריכוז של 1.25 מ"ג / מ"ל גורם לבעיות עם interpretability של בת ^9. בדרך כלל, בדיקות רעילות פוטנציאלית מומלץ מאוד עבור המצומד כל סם הפיק החדש.

הנה, הראינו את הפוטנציאל של PP-HSA המצומד בשימוש BAT לחשוף IgE בתיווך רגישות יתר. לעומת זאת, DF רגישות יתר אינה קשורה IgE שמפגינים חוסר הפעלת basophil בתגובה DF-HSA המצומד. חשוב לציין, במקרה של חוסר ודאות לגבי מנגנון IgE בתיווך, conjugates צריך להיות מוערך על פעילות מערכת החיסון על ידי במערכות assay במבחנה מבוססי תאים כפי שהוכח על DF ^4.

באמצעות התקנה של תיאר conjugating תרופות משקל מולקולרי נמוך קוולנטית למוביל מולקולות חלבון מתאים מספר של תגובות רגישות יתר כנגד תרופות כולל אנטיביוטיקה, NSAIDs אחרים, radiocontrast התקשורת, מרפי שרירים, הרדמה וכו 'עלול להיחקר על מעורבותם של IgE בתיווך מנגנון. לפיכך, BAT עשוי לשמש בנוסף את השיטות הקיימות לאבחון (מבחן עור, פרובוקציה אוראלי בדיקות).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / מכשיר	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
2 - (N-Morpholino) ethanesulfonic חומצה	סיגמא	M3671	-
7.8 x 300 מ"מ טפו ג'ל -G2000SWXL עמודה	Bioscience Tosoh	08540	-
BD FACSCanto II	בקטון דיקינסון	338962	-
ספסל העליון צנטריפוגות	סיגמא	-	-
דיקלופנק מלח נתרן	סיגמא	D6899	-
EDTA-Vacutainer	בקטון דיקינסון	368589	-
Flow2 שחקנים Kit	Bühlmann מעבדות	FK-CCR	הערכה אפקטיבית 14 יוני 2011 Flow2 שחקנים עכשיו שחקנים Flow
מערכת HPLC HP1100	Hewlett Packard	-	-
האדם סרום אלבומין	סיגמא	A9511	-
מעבדה צנטריפוגות	Eppendorf	-	-
N-אתיל-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	סיגמא	E6383	-
PBS טבליות	AppliChem	A9199	-
Propyphenazone נגזרת	המחלקה לביולוגיה מולקולרית, אוניברסיטת זלצבורג, אוסטריה	-	-
מטרף	Eppendorf	-	-
נתרן אזיד	סיגמא	S8032	-
נתרן כלורי (NaCl)	סיגמא	S1679	-
מימן סודיום קרבונט	סיגמא	90421C	-
נתרן hydroxid	סיגמא	S5881	-
סודיום פוספט	סיגמא	342483	-
גלאי טריפל מערך	Viscotek	TDA302	-
BioVortex אישי V-1 פלוס	Peqlab	90-V-1	-
המים באמבט 1012	GFL	1012	-