İlaç Aşırı duyarlılık IgE aracılığı ile Mekanizmalarının Araştırılması bazofil Etkinleştirme Test

Özet

Bazofil aktivasyon testi, IgE bağımlı alerji tespiti için güçlü bir araçtır In vitro. Burada, bazofil aktivasyon testi için optimize edilmiş bir protokol ilaç aşırı duyarlılık araştırmak için kullanılır. Kovalent ilaç-protein konjugatları ve fizikokimyasal karakterizasyonu ve verimli üretim için bir yöntem açıklanmıştır.

Özet

Propyphenazone (PP) ve diklofenak (DF) gibi non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar (NSAID) karşı aşırı duyarlılık reaksiyonları, alerjik ^reaksiyonlar 1 I-benzeri türü olarak tezahür edebilir . Klinik uygulamada, ilaç aşırı duyarlılık tanısı deri testleri güvenilir değildir ve oral provokasyon testi ² hasta için hayatı tehdit eden riskler taşımaktadır esas olarak hastanın öyküsü tarafından yapılır. Dolayısıyla, altta yatan bir IgE aracılı pathomechanism delil elde etmek zordur.

Burada, in vitro yöntem, ilaca duyarlı hastalarda in vivo olarak, alerjik efektör reaksiyon taklit edilen insan bazofiller kullanımına dayalı bir sunuyoruz. Ilaç alerjik hastalarda bazofil suçlu ilaç için spesifik IgE molekülleri taşıyan, IgE reseptörü crosslinking üzerine aktif ve alerjik effektör moleküllerin serbest hale gelir. Bazofil aktivasyonu CD63 yüzey ekspresyonu flow sitometri ³ kullanarak upregülasyonu belirlenmesi ile takip edilebilir.

Düşük molekül ağırlıklı ilaçların durumunda, konjugatları bazofiller IgE reseptörü crosslinking sağlamak için tasarlanmıştır. Şekil 1, iki temsilci NSAİİ tasvir gibi, PP ve DF, bir karboksil grubu ile lizin kalıntılarının temel amino grubu ile reaksiyona Kalkış Desteği (HSA) insan serum albumini için kovalent bağlıdırlar. DF, bir karboksil grubu içeren PP türevi organochemically önce çalışma ¹ sentezlenebilir sahipken, bu nedenle, ^doğrudan 4 kullanılabilir içsel bir karboksil grubu ve taşımaktadır .

Iki IgE reseptör molekülleri crosslinking garanti etmek için protein taşıyıcı molekül düşük molekül ağırlıklı bileşikler ve mekansal dağılımının kaplin derece önemlidir. Burada açıklanan protokol sıralı bir kırılma indeksi (RI) ve ultraviyole (UV) kaplin derecesinin belirlenmesi için algılama sistemi ile donatılmış yüksek performans boyut dışlama kromatografisi (HPSEC) geçerlidir.

Açıklanan metodoloji diğer ilaçlar için uygulanan olabilir, bazofil aktivasyon testi (BAT), ilaç aşırı duyarlılık IgE aracılı mekanizmaların belirlenmesi için kullanılan olma potansiyeli taşımaktadır. Burada, PP aşırı duyarlılık IgE aracılı ve DF aşırı duyarlılık, BAT, non-IgE aracılı olarak belirlemek.

Protokol

1. Ilaç konjugatları hazırlanması

1. 1,5 ml reaksiyon tüp içinde 10 mg 1 ml dH ₂ O DF çözülür. Bu DF çözüm daha fazla ilerlemeden 95 ul kullanın. PP konjuge HSA 500 ul 0.3 M sodyum hidroksit (NaOH) 30.4 mg PP türev (304 g / mol) çözülür.
2. (N-morfolino) ethanesulfonic asit (MES) tampon pH 6,5 - 95 ul çözünmüş DF - 430,6 ul _{dH 2} O ve 100 ul 0.5 M 2 ekleyin . 33.1 ul dH ₂ O, ve PP örnek 2 M MES tampon pH 2.9 140 ul ekleyin .
3. 57.5 taze hazırlanmış N-etil-N 'ul ekle DF örnek mg / ml konsantrasyon, ya da 100 10 ul EDC çözüm _{dH 2} O çözünmüş carbodiimide hidroklorür (EDC) stok solüsyonu (3-Gaz sistemlerinde ) PP örnek. Vortex 1 dakika boyunca örnekleri.
4. Her bir örnek için 118 mg / ml 'lik bir konsantrasyon ile HSA çözüm 16.9 ul ekleyin.
5. 300 mermi / dak sallayarak ederken örnekleri 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
6. DF ve PP örnekleri 3 kez, her biri için birkaç saat fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 2 litre karşı Dialyze. 4 ° C'de bütün diyaliz adımları uygulayın.
7. Örnek 10 dakika 14.000 xg'de santrifüjleyin ve supernatant içeren DF veya konjuge HSA PP toplamak.
8. Proteinleri SDS-PAGE gerçekleştirerek% 12 jeller kullanarak süpernatant kontrol edin. Bir jel yuvaya yaklaşık 12 mikrogram HSA konjuge yükleyin.

2. Ilaç konjugatları kavrama oranı (Şekil 2) belirleyin

1. 150 mM NaCl ve% 0.05 sodyum azid içeren 100 mM sodyum fosfat tamponu pH 6.5 HPSEC DF ve PP konjugatları kaplin oranı analizi için kullanın. TSK-Gel G2000 _SWXL sütun bir 7.8 mm x 300 kullanın.
2. Online birleştiğinde RI ve UV dedektör sistemi kullanarak sinyallerin tespit gerçekleştirin.
3. DH ₂ O 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyon ile HSA standart bir örnek hazırlayın Dedektör kalibrasyonu için 50 ul HSA standart solüsyon enjekte edilir.
4. RI sabiti k _RI ve dedektör UV sabiti k _UV hesaplayın. Formüller alan _RI = k _RI * [(dn / dc) _HSA * c Kalkış Desteği (HSA) ve alan _UV = k _UV * [(dA / dc) _HSA * c Kalkış Desteği (HSA)] (dn / dc) _HSA = 0,185 ve (dA / dc) _HSA = 0,518 ^5.
5. DF ve her iki standartları, 5, 10, ve 30 nmol miktarda kolaylıkla enjekte edilebilir HPSEC için PP türev standartları hazırlayın.
6. (Dn / dc) için _ilaç ve her iki standardın (dA / dc) _ilaç ortalama değerleri hesaplayın. DF, (dn / dc) 39.000 ± 0.010 (dA / dc) ± 0,493 0,235 tespit edildi. PP, 0.328 ± 0.016 (dn / dc) ve (dA / dc) 53,155 ± 2,464 tespit edildi.
7. HPSEC ilaç konjügatları enjekte edilir ve RI ve UV pik alanları belirlemek.
8. DF, PP türev, ve HSA konsantrasyonu = k _RI * (dn / dc) _ilaç * c (ilaç) + (dn / dc) _HSA * c Kalkış Desteği (HSA) ve alan _UV iki denklemler alanında _RI çözme hesaplayın = k _UV * [(dA / dc) _ilaç * c (ilaç) + (dA / dc) _HSA * c] bilinmeyenli Kalkış Desteği (HSA).

3. BAT kullanarak ilaç konjugatları

1. Yedi akış sitometri şişeleri hazırlayın ve içeriklerine bağlı olarak etiket: lekesiz kontrol, negatif kontrol, pozitif kontrol ve ilaç konjugatları.
2. B-CCR-STB stimülasyon, lekesiz ve negatif kontrol için ayrılmış şişeleri içine tampon (Flow2 CAST, Buhlmann Laboratuvarları, Schönenbuch, CH) Pipet 50 ul. Pozitif kontrol olarak, bir anti-FcεRI çözüm Flow2 CAST seti tarafından sağlanan 50 ul kullanın. 0.02 -20 mg / ml DF konjuge ve PP konjuge (200 ul bir test hacmi son konsantrasyonları) 1:10 seyreltme serisi oluşturarak, ilaç konjugatları için ayrılmış şişeleri, konjuge çözüm uygun miktarlarda ekleyin. Bu titrasyon deneyleri, her bir hasta numunesi için en uygun bazofil aktivasyon konsantrasyonunu belirlemek için yapılmalıdır.
3. Her bir tüp ve 50 ul hasta EDTA tam kan için 100 ul stimülasyon tampon ekleyin. Örnekleri dikkatlice karıştırın.
4. Pipet 20 ul Flow2 CAST boyama fikoeritrin (PE) ve her tüp floresein izotiyosiyanat (FITC) ile işaretli anti-CD63 antikorları ile işaretli anti-CCR3 antikorları içeren reaktif ve tekrar karıştırın. Lekesiz numune boyama reaktif pipetle etmeyin!
5. 37 ° C'lik su banyosunda 45 dakika örnekleri inkübe edin.
6. 5 dakika boyunca buz üzerinde reaksiyon durdurun.
7. Her flakon ve vorteks hafifçe 2.0 ml Flow2 CAST parçalama reaktifi eklenerek eritrositler Lyse. Numune karanlık oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
8. 500 xg'de 5 dakika ve dikkatle boşaltmak süpernatant için numuneleri santrifüjleyin.
9. Akış sitometri kadar buz üzerinde 500 ul Flow2 CAST yıkama tamponu ve mağaza hücrelerin tekrar
10. Akış sitometresinin gerilim s ayarlayınileri ve yan dağılım (FSC, SSC) yarlar lekesiz örnek elde edilirken.
11. Kapısı hücreleri SSC-PE arsa SSC-FSC arsa lenfositler olarak öngördü. Bazofiller CCR3 ^hi SSC ^lo ve kapı FITC-PE arsa içine PE etiketli anti-CCR3 antikor tarafından tespit edilir. Aktive bazofiller tespit anti-CD63 antikor FITC etiketli.
12. CD63 ^yüksek negatif kontrol olarak bazofiller cut-off maksimum% 2,5 'i ayarlayın. >% 5 bazofiller CD63 ^hi ve negatif kontrol MFI bölünmüş örnek ortalama floresan indeksi (MFI) 2 aşarsa (Şekil 3), örnek bir bazofil aktivasyonu için pozitif olarak kabul edilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Bu deney, IgE bağımlı ilaç aşırı duyarlılık tespit etmek için yararlı bir araç olarak BAT değerlendirir. NSAİİ Protein konjugatları bazofil aktivasyonu için kullanılır. HPSEC olarak RI ve UV saptaması toplama devlet, kaplin derece ve konjugatları etkin verim ile belirlenir. Şekil 4'te görüldüğü gibi, DF konjugatları 43.5% 5.0 DF / HSA kaplin derecesi ile monomerik kaldı. Agrega için 9.5 kaplin derece tespit edildi. Propyphenazone konjuge 68.5% 21.2 kaplin derecesi ile monomerlerin oluştuğu gösterilmiştir. Agregaların kaplin derece 27,9 oldu. DF konjugatları belirlenen kaplin derece toplam 7.6 DF ve PP konjugatları 23.2 idi.

BAT IgE bağımlı NSAİİ aşırı duyarlılık reaksiyonları soruşturma izin optimize koşulları (konjugatları konsantrasyonu, stimülasyon süresi) altında konjugatları ile yapıldı. Bazofil% 20,6 aktif floresan bir günlük vardiya ile karakterizedir: Şekil 5 de görüldüğü gibi, sadece PP konjuge bazofil aktivasyonu CD63 yüzey ekspresyonu bir upregülasyonu tarafından görüntülendi tetiklemek mümkün . MFI, 1893 için 4.9 kat artarak 386 (negatif kontrol). Buna karşılık, DF konjuge kullanarak bazofiller sadece% 3.1,% 5 cut-off altında olduğu aktive edildi. Ayrıca, MFI 210 197 (negatif kontrol), 1.1 (sınırı 2,0) bir faktör sadece arttı. Testi geçerliliği tarafından verilen (i) <% 5 negatif kontrol bazofil aktivasyonu, bazofil ICSI'nin floresan yoğunluğu (ii) bir günlük vardiya, ve (iii)>% 50 aktif bazofiller (pozitif kontrol).

Şekil 1 HSA DF ve PP türevi çiftlenmesi. Çözüldükten sonra ilaç, su, MES tampon ve EDC (kaplin reaktif) eklenir. HSA ilaç çözümlere pipetlenir önce örnekleri 1 dakika için vortekslenmiş. , Oda sıcaklığında sallayarak 2 saat içinde ilaçlar HSA kovalent bağlanır. Monomerler yanı sıra agrega neden olabilir.

Şekil 2 kaplin derece hesaplanması. İlk olarak, _RI ve k _UV k sabitleri belirlenmiştir. Bu nedenle, bilinen konsantrasyon ile HSA standardı HPSEC sistemi içine enjekte edilir. (Dn / dc) ve HSA (dA / dc) sırasıyla ^5, 0,185 ve 0,518 değerleri verilmiştir. Pik alanları sabitleri hesaplamak için kullanılır. İkincisi, her ilaç için üç standartları ilaç ve konsantrasyon-RI ve UV alanları belirlemek için enjekte edilir. Yukarıdaki adımları, _k RI ve _k UV sabitleri bilinen bu yana, ilaca özgü (dn / dc) ve (dA / dc) türevleri hesaplanabilir . Üçüncü olarak, ilaç-HSA konjugatları HPSEC içine enjekte edilir. Sonuçta elde edilen pik alanları iki bilinmeyen değişkenler ile iki denklemleri çözerek tepe başına ilaç ve HSA konsantrasyonlarını hesaplamak için kullanılır.

Şekil 3 bazofil yolluk. Lenfositleri forward scatter karşı kapılı yan dağılım (SSC-FSC arsa) gibi hücre öngördü. Bazofiller CCR3 ^hi SSC ^lo kapılı lenfositler (SSC CCR3-PE arsa) olarak tanımlanır. Bazofil aktivasyon (CD63 ^hi), CD63-FITC-CCR3-PE arsa analiz edilmektedir. Negatif kontrol CD63 ^hi kalan maksimum% 2.5 bazofiller cut-off ayarlamak için kullanılır.

Şekil 4 ilaç konjugatları kaplin derece kararlı. RI ve UV sinyallerinin ilaç HSA konjugatları agrega (düşük tutma hacmi salınımlı) ve monomerlerin (yüksek tutma hacmi az salınımlı) temsil eden iki tepe göstermektedir. Monomerlerin ve agrega yüzdesi (RI sinyalleri tespit) ve kaplin derece (n = 1) tasvir edilmektedir.

Şekil 5 bazofil activatitest. CD63-FITC-CCR3-PE araziler (n = 1) ilaç bileşimi ile aktive örnekleri, negatif kontrol, pozitif kontrol sonuçları gösterilmiştir.

Tartışmalar

BAT iyi kurulmuş henüz IgE aracılı allerjik hastalık ^6,7 tanısı için rutin olarak kullanılan yöntem olsa da. Ilaç aşırı duyarlılık için düşük molekül ağırlıklı bileşikler çapraz IgE reseptörleri, bazofil aktivasyon ⁸ için bir ön koşul değildir, ancak, bunun uygulanabilirliği tehlikeye düşer. Bu nedenle, soruşturma altında ilaçların kovalent uygun taşıyıcı proteinler (örneğin HSA) ile birleştiğinde olması gerekir. Daha da önemlisi, kaplin derecesi (yani taşıyıcı protein başına ilaç moleküllerinin sayısı) konjugatları (yani IgE reseptörü cross-linking) immünolojik aktivite garanti etmek için kontrol edilmesi gerekiyor. Teorik olarak, taşıyıcı molekül başına iki hapten IgE reseptörü için yeterli olmalıdır çapraz bağlama ve HSA başına beş DF molekülleri gibi birkaç hücre bazlı analiz ⁴ mediatör salınımını tetikler görülmüştür. Her iki konjugatları, PP-HSA ve DF-HSA, yeterince yüksek bir bağlantı derecesi (HPSEC) gösterilecek ve onlara BAT kullanım için uygun reaktifler immünolojik etkin olacak şekilde tespit edilmiştir. Bir diğer sorun, ana ilacın yerine metaboliti olarak aşırı duyarlılık reaksiyonuna neden olabilir, ilaç metabolitleri bir rol oynayabilir olabilir. DF durumunda, bu olasılığı daha önce beş büyük Faz I metabolitleri ve bir bağ ^varyant 4 kullanılarak ayrıntılı olarak değerlendirilmiştir . Açıklanan teknik mastering için önemli faktörler kan örneği ( 500) ve stimülasyon koşullarının optimizasyonu (zaman, doz) kalite içerir. Buna ek olarak, bu bile pozitif kontrol (antikor IgE reseptörü yöneltilen) tespit edilmesi ile reaksiyona girmeyen olmayan-yanıt olarak adlandırılır. Bu nedenle, doğrulama kriterleri, pozitif kontrol olarak bir anti-FcεRI antikor dahil etmek zorunda. Ilaç konjugatları kullanarak önemli bir avantajı DF-HSA konjuge anti-BAT ⁴ FcεRI antikor ile birlikte stimülasyon için gösterilen saf ilaçlar, aksine non-toksik ortaya çıktığı bir gerçektir. Saf DF, aksine, 1.25 mg / ml konsantrasyonda BAT ⁹ yorumlanabilirliğini sorunlara neden sitotoksik etkileri gösterir. Genel olarak, potansiyel sitotoksisite test kuvvetle her yeni üretilen ilaç bileşimi için tavsiye edilir.

Burada, BAT IgE aracılı aşırı duyarlılık ortaya çıkarmak için kullanılan PP-HSA konjuge potansiyel göstermiştir. Buna karşılık, DF aşırı duyarlılık DF-HSA konjuge yanıt bazofil aktivasyon eksikliği gösterdiği IgE ile ilişkili değildir. Önemlisi, IgE aracılı bir mekanizma ile ilgili belirsizlik durumunda, ^{konjugatları} DF 4 gösterildiği gibi, in vitro hücre tabanlı test sistemleri immünolojik aktivite için değerlendirilmek üzere.

Uygun protein taşıyıcı kovalent düşük molekül ağırlıklı ilaçların conjugating açıklanan kurulumu kullanarak, antibiyotikler de dahil olmak üzere ilaç, diğer NSAID, radiocontrast medya, kas gevşeticiler, anestezi karşı aşırı duyarlılık reaksiyonları bir dizi moleküller, vb IgE aracılıklı bir katılımı için soruşturma olabilir mekanizması. Bu nedenle, BAT tanı (cilt testi, oral provokasyon testi) mevcut yöntemlere ek olarak hizmet verebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / cihaz Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2 - (N-morfolino) ethanesulfonic asit	Sigma	M3671	-
7.8 x 300 mm TSK Jel -G2000SWXL sütun	Bioscience Tosoh	08540	-
BD FACSCanto II.	Becton Dickinson	338962	-
Masa üstü santrifüj	Sigma	-	-
Diklofenak sodyum tuzu	Sigma	D6899	-
EDTA-Vacutainer	Becton Dickinson	368589	-
Flow2 CAST Seti	Buhlmann Laboratuvarları	FK-CCR	Etkili 14 Haziran 2011 Flow2 CAST kiti Akış CAST
HP1100 HPLC sistemi	Hewlett Packard	-	-
İnsan Serum Albumin	Sigma	A9511	-
Laboratuvar Santrifüj	Eppendorf	-	-
N-etil-N'-(3-Gaz sistemlerinde) carbodiimide hidroklorür (EDC)	Sigma	E6383	-
PBS tablet	¸	A9199	-
Propyphenazone türevi	Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı, Salzburg Üniversitesi, Avusturya	-	-
Shaker	Eppendorf	-	-
Sodyum azid	Sigma	S8032	-
Sodyum klorür (NaCl)	Sigma	S1679	-
Sodyum hidrojen karbonat	Sigma	90421C	-
Sodyum hydroxid	Sigma	S5881	-
Sodyum fosfat	Sigma	342483	-
Üçlü dedektör dizi	Viscotek	TDA302	-
Kişisel BioVortex V-1 artı	Peqlab	90-V-1	-
Su banyosu 1012	GFL	1012	-