Активация базофилов Тест для исследования IgE-опосредованной механизмов в наркотиках Гиперчувствительность

Резюме

Базофилов активации теста является мощным инструментом для выявления IgE-зависимой аллергии В пробирке. Здесь, оптимизированный протокол для теста активации базофилов используется для исследования наркотиков гиперчувствительности. Метод эффективного производства ковалентных наркотиков белковые конъюгаты и их физико-химических характеристик описывается.

Аннотация

Аллергические реакции на нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), как propyphenazone (ПП) и диклофенака (DF) могут проявляться как тип I типа аллергических реакций ^1. В клинической практике диагноз лекарственной чувствительности в основном выполняются пациента истории, как кожная проба не является надежным и устного тестирования провокация медведи опасных для жизни риск для пациента ^2. Таким образом, доказательство основной IgE-опосредованной pathomechanism трудно получить.

Здесь мы представляем в пробирке метод, основанный на использовании человеческих базофилов, полученных от незаконного-сверхчувствительных пациентов, который имитирует аллергические реакции эффектора в естественных условиях. Как базофилов лекарственно-аллергических больных нести IgE молекулы, специфичные для виновника наркотики, они становятся активируется при сшивания рецептор IgE и отпустите аллергические эффекторных молекул. Активация базофилов могут контролироваться с помощью определения регуляция CD63 поверхности выражения с помощью проточной цитометрии ^3.

В случае низкого молекулярного веса наркотиков, конъюгаты которые созданы для IgE рецепторов сшивания на базофилы. Как показано на рисунке 1, двух представителей НПВП, РР и DF, ковалентно связаны с сывороточного альбумина человека (HSA) через карбоксильную группу, реагирующих с первичной аминогруппы остатков лизина. DF осуществляет внутреннюю карбоксильной группы и, таким образом, могут быть использованы непосредственно ^4, тогда как карбоксильная группа содержащих производные ПП должно было быть синтезированы organochemically до исследования ^1.

Связь степени низкомолекулярных соединений на молекулы белка-носителя и их пространственного распределения важно гарантировать сшивание двух молекул IgE рецептором. Описанный здесь протокол применяется высокопроизводительный-гель-хроматографии (HPSEC), оснащенный последовательным показателем преломления (RI) и ультрафиолетового (УФ) система обнаружения для определения степени связи.

Как описано методика может быть применена для других препаратов, тест активации базофилов (БАТ) несет потенциально могут быть использованы для определения IgE-опосредованные механизмы наркотиков гиперчувствительности. Здесь мы определяем ПП гиперчувствительности как IgE-опосредованной гиперчувствительности и DF, как не-IgE-опосредованной по НДТ.

протокол

1. Подготовка наркотиков конъюгатов

1. Растворите 10 мг DF в 1 мл дН ₂ O в 1,5 трубки реакции мл. В дальнейшем исходя использовать 95 мкл этого DF решение. Для сопряженных PP для HSA растворить 30,4 мг PP производные (304 г / моль) в 500 мкл 0,3 М раствора гидроксида натрия (NaOH).
2. Добавить 430,6 мкл дН ₂ O и 100 мкл 0,5 М 2 - (N-морфолино) этансульфоновая кислоты (MES) буфера рН 6,5 до 95 мкл растворенных DF. Добавить 33,1 мкл дН ₂ O и 140 мкл 2 М MES буфера рН 2,9 до образцов ПП.
3. Добавить 57,5 мкл свежеприготовленного N-этил-N '- (3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорид (EDC) маточного раствора, растворенного в дН ₂ O с концентрацией 100 мг / мл до образца DF, или 10 мкл раствора EDC для образец ПП. Vortex образцы в течение 1 минуты.
4. Добавить 16,9 мкл раствора HSA с концентрацией 118 мг / мл до каждого образца.
5. Инкубируйте образцы в течение 2 часов при комнатной температуре при встряхивании на 300 выстрелов / мин.
6. Диализировать DF и PP образцов 3 раза по сравнению с 2 литра фосфатно-солевом буфере (PBS) рН 7,4 в течение нескольких часов каждый. Выполните все шаги диализа при 4 ° C.
7. Центрифуга образца 10 минут при 14 000 мкг и собирают супернатант, содержащий DF или ПП конъюгированных с HSA.
8. Проверьте супернатант для белков, выполняя SDS-PAGE, используя 12% гелей. Нагрузка около 12 мкг HSA сопряженных в одну гель слот.

2. Определите скорость связи наркотиков конъюгатов (рис. 2)

1. Для анализа связи скорость DF и PP конъюгатов по HPSEC использовать 100 мМ натрий-фосфатного буфера рН 6,5, содержащего 150 мМ NaCl и 0,05% азида натрия. Используйте 7,8 х 300 мм, TSK-гель-G2000 _SWXL колонке.
2. Выполнить обнаружение сигналов с помощью онлайн-связанной РИ и системы УФ-детектор.
3. Подготовка HSA стандартного образца с концентрацией 1 мг / мл в дН ₂ O. Для калибровки детекторов вводят 50 мкл HSA стандартное решение.
4. Рассчитать Р. _Р. постоянной А и УФ постоянной _УФ к для детектора. Использование формулы _{Р. И.} площадь = к _RI * [(дп / постоянного тока) * с _HSA (ЧСА)] и области _УФ = к _УФ * [(DA / постоянного тока) * с _HSA (ЧСА)] с (дп / постоянного тока) _HSA = 0,185 и (дА / постоянного тока) _HSA = 0,518 ^5.
5. Подготовка DF и PP производные стандарты HPSEC, что 5, 10 и 30 нмоль количества обоих стандартов могут быть легко введены.
6. Рассчитать средние значения (дп / постоянного тока) и _{наркотиков} (DA / DC), _{препарат} для обоих стандартов. Для DF, (дп / постоянного тока) от 0,235 ± 0,010 и (DA / постоянного тока) от 39,000 ± 0,493 определялась. Для ПП, (дп / постоянного тока) от 0,328 ± 0,016 и (DA / постоянного тока) от 53,155 ± 2,464 определялась.
7. Inject наркотиков конъюгатов на HPSEC и определить их РИ и УФ площадей пиков.
8. Рассчитайте концентрацию DF, ПП производной, и АСП, решая два уравнения площадь _Р. = к _RI * [(дп / постоянного тока) * с _{наркотиками} (наркотиками) + (дп / постоянного тока) * с _HSA (ЧСА)] и _{УФ-области} = к _УФ * [(DA / постоянного тока) * с _{наркотиками} (наркотиками) + (дА / постоянного тока) * с _HSA (ЧСА)] для неизвестных.

3. BAT использованием наркотиков конъюгатов

1. Подготовка семь чаш проточной цитометрии и маркировать их в зависимости от их содержания: неокрашенных контроля, отрицательного контроля, положительного контроля и наркотиков конъюгатов.
2. 50 мкл B-CCR-СТБ стимуляция буфера (производительности2 CAST, Бюльман Laboratories, Schönenbuch, CH) в флаконах зарезервированы для неокрашенных и отрицательного контроля. В качестве положительного контроля, использовать 50 мкл анти-FcεRI решение предоставляемые производительности2 CAST комплект. Добавить соответствующее количество сопряженных решение флаконах зарезервированы для наркотиков конъюгатов, создав серию разбавлении 1:10 от 0,02 -20 мкг / мл DF сопряженных и ПП сопряженных (конечная концентрация в анализе объеме 200 мкл). Эти эксперименты титрования должны быть выполнены, чтобы определить концентрацию оптимальной активации базофилов для каждого пациента образца.
3. Добавить 100 мкл буфера для стимуляции в каждую пробирку и ЭДТА 50 мкл пациента цельной крови. Смешайте образцы тщательно.
4. Внесите 20 мкл производительности2 CAST окрашивания реагентов, содержащих противопехотные CCR3 антител, меченных фикоэритрин (PE) и анти-CD63 антител, меченных флуоресцентной изотиоцианат (FITC) в каждую пробирку и снова перемешать. Не пипетки окрашивания реагента в неокрашенных образцов!
5. Инкубируйте образцы в течение 45 минут при 37 ° С водяной бане.
6. Остановить реакцию на льду в течение 5 минут.
7. Lyse эритроцитов, добавляя 2,0 мл топлива 2 CAST лизирующего реагента для каждого флакона и вихревые мягко. Инкубируйте образцы в темноте в течение 10 минут при комнатной температуре.
8. Центрифуга образцы в течение 5 минут при 500 мкг и тщательно сцеживать супернатант.
9. Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера производительности2 CAST мыть и хранить на льду, пока проточной цитометрии.
10. Отрегулируйте напряжение с потоком цитометр вettings для прямого и бокового рассеяния (FSC, SSC) при приобретении неокрашенных образцов.
11. Ворота клетки предсказать, как лимфоциты SSC-ФСБ заговор с целью SSC-PE сюжет. Базофилы идентифицируются PE меченные анти-антитело, как CCR3 CCR3 ^привет SSC ^вот и ворота их в FITC-PE сюжет. Анти-CD63 антител обнаружения активированных базофилов помечена FITC.
12. Установить светотеневой границы, не более 2,5% базофилов, как CD63 ^привет в отрицательного контроля. Проба считается положительной для активации базофилов, если> 5% базофилов CD63 ^привет и средний индекс флуоресценции (МФО) образца, деленная на МФО отрицательного контроля превышает 2 (рис. 3).

4. Представитель Результаты:

Этот эксперимент оценивает НИМ, полезным инструментом для выявления IgE-зависимых наркотиками гиперчувствительности. Белки конъюгатов НПВП используются для активации базофилов. По HPSEC с РИ и УФ-детектированием агрегатного состояния, степени связи и эффективного выхода конъюгатов определены. Как показано на рисунке 4 показывает, 43,5% конъюгатов DF остался мономерных с связи степень 5,0 DF / HSA. Для агрегатов связи степень 9,5 было определено. Propyphenazone сопряженных было показано, что состоят из 68,5% мономеров с муфта степени 21,2. Связь степени агрегатов 27.9. В целом, определяется связью степень конъюгатов DF составил 7,6 DF и сопряженных ПП составила 23,2.

БАТ осуществляется с сопряженными в оптимальных условиях (концентрация конъюгатов, стимулирование времени) позволило исследование IgE-зависимых реакций гиперчувствительности на НПВП. Как показано на рисунке 5, только ПП сопряженных смог вызвать активацию базофилов визуализируется регуляция в CD63 поверхности выражение: 20,6% базофилы были активированы характеризуется лог-сдвиг в интенсивности флуоресценции. МФО увеличился на коэффициент 4,9 от 386 (отрицательный контроль) в 1893 году. В противоположность этому, использование DF сопряженных только 3,1% базофилы были активированы которая была ниже 5% отсечки. Кроме того, МФО увеличился всего на коэффициент 1,1 (предел 2,0) от 197 (отрицательный контроль) до 210. Анализ действия определяется формулой (я) <5% базофилов активации в отрицательном контроле, (II) лог-сдвиг в интенсивности флуоресценции базофилов субпопуляции, и (III)> 50% активированных базофилов (положительный контроль).

Рисунок 1. Взаимодействие производных DF и НД HSA. После растворения лекарства, воду, МЧС буфер, и EDC (муфта реагента) добавляются. Образцы встряхивали в течение 1 минуты, прежде чем HSA является пипеткой к препарату решений. В течение 2 часов тряски при комнатной температуре препараты ковалентно связываются с HSA. Мономеры, а также агрегатов может привести.

Рисунок 2. Расчет связи градусов. Во-первых, постоянные к _РИ и к _УФ определены. Таким образом, HSA стандарт с известной концентрацией вводится система HPSEC. (Дп / постоянного тока) и (дА / DC) из HSA приведены значения 0,185 и 0,518, соответственно, ^5. Площадей пиков используются для расчета констант. Во-вторых, для каждого препарата три стандарта вводятся для определения наркотиков и концентрации конкретных РИ и УФ областях. Так как _{Р. И.} К и константы к _УФ известны из описанных выше шагов, наркотиков конкретные (дп / постоянного тока) и (дА / постоянного тока) производные могут быть вычислены. В-третьих, наркотики HSA конъюгатов вводятся в HPSEC. В результате областях пик используются для расчета концентрации наркотиков и HSA на пик при решении двух уравнений с двумя неизвестными.

Рисунок 3. Базофилов стробирования. Клетки предсказать, как лимфоциты закрытого разброс сторону по сравнению вперед рассеяния (SSC-ФСБ участка). Базофилы определены как CCR3 ^привет SSC ^вот из закрытого лимфоцитов (SSC-CCR3-PE участка). Базофилы анализируются для активации (CD63 ^{привет)} в CD63-FITC-CCR3-PE сюжет. Отрицательный контроль используется для установки отсечки не более 2,5% базофилы оставшиеся CD63 ^{привет.}

Рисунок 4. Преисполнен связи градусов наркотиков конъюгатов. RI-и УФ-сигналы показывают два пика представляющие агрегаты (элюированием при низкой громкости удержание) и мономеров (элюированием при высоком уровне громкости удержание) лекарственно-HSA конъюгатов. Проценты мономеров и агрегаты (определяется по Р. сигналов) и их связь градусов изображены (п = 1).

Рисунок 5. Базофилов activatiна тест. Результаты наркотиков сопряженных активированных образцов, отрицательного контроля и положительного контроля приведены в CD63-FITC-CCR3-PE участков (п = 1).

Обсуждение

НДТ устоявшихся хотя пока еще не широко используется метод диагностики IgE-опосредованные аллергические заболевания ^6,7. Для приготовления гиперчувствительность, однако, возможность его применения снизился в низкомолекулярных соединений не в состоянии сшивки IgE рецепторов, предпосылкой для активации базофилов ^8. Таким образом, препараты при расследовании должны быть ковалентно связаны с белками подходящий носитель (например, HSA). Важно отметить, что степень связи (т.е. количество наркотиков молекул на белок-носитель) должна находиться под контролем, чтобы гарантировать иммунологическую активность (т.е. IgE рецепторов сшивания) конъюгатов. Теоретически, два гаптенов за молекулой-носителем должна быть достаточной для рецепторов IgE сшивания и всего лишь пять DF молекул в HSA, как было показано, чтобы вызвать посредника выпуска в клеточной анализа ^4. Оба конъюгатов, ПП-HSA и DF-HSA, были определены для отображения достаточно высокой степенью связи (HPSEC) и быть иммунологически активных делает их пригодными для использования реагентов в НИМ. Еще один вопрос, может быть, метаболитов наркотиков может играть роль, так как метаболита вместо исходного препарата может вызвать реакции гиперчувствительности. В случае DF, эта возможность была оценена подробно ранее с помощью пяти основных этапа I метаболитов и одна связь вариант ^4. Важными факторами для освоения Описанная методика включает качество крови (<12 часов с момента забора крови, количество обнаруженных базофилов> 500) и оптимизации стимуляции условий (время, доза). Кроме того, так называемые, отказавшихся отвечать, которые даже не вступают в реакцию с положительным контролем (антитела, направленные против рецепторов IgE), должны быть идентифицированы. Таким образом, проверка критериев для включения анти-FcεRI антител в качестве положительного контроля. Важным преимуществом использования наркотиков конъюгатов является тот факт, что они появляются нетоксичным в отличие от чистых препаратов, как показано на DF-HSA сопряжены совместной стимуляции анти-FcεRI антител в BAT ^4. Чистая DF, напротив, показывает цитотоксических эффектов при концентрации 1,25 мг / мл, возникают проблемы со интерпретируемости BAT ^9. Как правило, тестирование для потенциальных цитотоксичность настоятельно рекомендуется для всех вновь произведенных наркотиков сопряжены.

Здесь мы показали потенциал PP-HSA сопряженных использоваться в BAT выявить IgE-опосредованной гиперчувствительности. В отличие от DF гиперчувствительности не связан с IgE свидетельствует отсутствие активации базофилов в ответ на DF-HSA сопряжены. Важно отметить, что в случае неопределенности в отношении IgE-опосредованной механизм, конъюгаты должны быть обследованы на иммунологическую активность в пробирке клеточных систем на основе анализа, как это было показано для DF ^4.

Использование описанной установки сопряжения низкомолекулярные препараты вес ковалентно подходящим носителем белковых молекул число реакций гиперчувствительности против наркотиков в том числе антибиотиков, других НПВС, радиоконтрастного СМИ, миорелаксанты, анестетики и т.д., могут быть исследованы для участия IgE-опосредованной механизм. Таким образом, БАТ может служить дополнением к существующим методам диагностики (кожный тест, устное тестирование провокация).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента / устройство	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
2 - (N-морфолино) этансульфоновая кислоты	Сигма	M3671	-
7,8 х 300 мм TSK гель -G2000SWXL колонка	Tosoh Bioscience	08540	-
BD FACSCanto II	Becton Dickinson	338962	-
Настольная центрифуга	Сигма	-	-
Диклофенак натриевая соль	Сигма	D6899	-
ЭДТА-Vacutainer	Becton Dickinson	368589	-
Производительности2 CAST Kit	Бюльман лаборатории	FK-CCR	Эффективное CAST 14 июня 2011 производительности2 комплект теперь поток CAST
HP1100 ВЭЖХ системы	Hewlett Packard	-	-
Сывороточного альбумина человека	Сигма	A9511	-
Лаборатория центрифуг	Эппендорф	-	-
N-этил-N'-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорид (EDC)	Сигма	E6383	-
PBS таблетки	AppliChem	A9199	-
Propyphenazone производные	Отдел молекулярной биологии Университета г. Зальцбург, Австрия	-	-
Шейкер	Эппендорф	-	-
Азид натрия	Сигма	S8032	-
Хлорид натрия (NaCl)	Сигма	S1679	-
Карбоната натрия водорода	Сигма	90421C	-
Натрий hydroxid	Сигма	S5881	-
Фосфат натрия	Сигма	342483	-
Тройной матричным детектором	Viscotek	TDA302	-
Личные BioVortex V-1 плюс	Peqlab	90-В-1	-
Водяная баня 1012	GFL	1012	-