Test d'activation des basophiles pour l'enquête des IgE dans les mécanismes d'hypersensibilité médicamenteuse

Résumé

De test d'activation des basophiles est un outil puissant pour la détection des allergies IgE-dépendante In vitro. Ici, un protocole optimisé pour le test d'activation des basophiles est utilisée pour étudier hypersensibilité médicamenteuse. Une méthode pour la production efficace de covalentes drogue-protéine conjugués et leur caractérisation physico-chimique est décrite.

Résumé

Des réactions d'hypersensibilité contre le non-stéroïdiens anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) tels que propyphenazone (PP) et le diclofénac (DF) peut se manifester comme de type I-like réactions allergiques ^1. En pratique clinique, le diagnostic d'hypersensibilité médicamenteuse est principalement effectué par les antécédents du patient, comme les tests cutanés ne sont pas fiables et les tests de provocation orale porte des risques mortels pour les ² patients. Par conséquent, les preuves d'un sous-jacent IgE pathomécanisme est difficile à obtenir.

Ici, nous présentons une méthode in vitro basée sur l'utilisation des basophiles humains issus de patients hypersensibles aux médicaments qui imite la réaction allergique effectrices in vivo. Comme les basophiles de drogue chez les patients allergiques porter des molécules d'IgE spécifiques pour le médicament coupable, ils deviennent activés lors de réticulation du récepteur d'IgE et la libération des molécules effectrices allergiques. L'activation des basophiles peut être contrôlé par la détermination de la régulation positive de l'expression en surface CD63 en utilisant la cytométrie en flux ^3.

Dans le cas de médicaments de faible poids moléculaire, conjugués sont conçus pour permettre la reticulation des récepteurs IgE sur les basophiles. Comme le montre la figure 1, deux représentants des AINS, PP et DF, sont liés de manière covalente à l'albumine sérique humaine (HSA) par un groupe carboxyle réagir avec le groupe amino primaire des résidus lysine. DF porte un groupe carboxyle intrinsèques et, par conséquent, peut être utilisé directement ^4, alors un groupe contenant carboxyle dérivé du PP a dû être synthétisés organochemically avant l'étude ^1.

Le degré de couplage des composés de faible poids moléculaire de la molécule de protéine porteuse et leur répartition spatiale est important de garantir réticulation de deux molécules réceptrices IgE. Le protocole décrit ici s'applique chromatographie d'exclusion haute performance de taille (HPSEC) équipé d'un indice de réfraction séquentielle (RI) et ultra violet (UV) système de détection pour la détermination du degré de couplage.

Comme la méthodologie décrite peut être appliquée pour d'autres drogues, le test d'activation des basophiles (BAT) porte le potentiel d'être utilisé pour la détermination des IgE dans les mécanismes d'hypersensibilité médicamenteuse. Ici, nous déterminons que PP hypersensibilité IgE médiée et hypersensibilité DF comme non IgE médiée par BAT.

Protocole

1. Préparation des conjugués de drogue

1. Dissolvez 10 mg dans 1 ml de dH O ₂ DF dans un tube de 1,5 ml de réaction. Dans la procédure utilisation ultérieure 95 ul de cette solution DF. Pour conjuguer PP à la HSA dissoudre 30,4 mg PP dérivés (304 g / mol) dans 500 pi 0,3 M d'hydroxyde de sodium (NaOH).
2. Ajouter 430,6 ul dH ₂ O et 100 ul 0,5 m 2 - (N-morpholino) éthanesulfonique (MES) tampon pH 6,5 à 95 ul de DF dissous. Ajouter 33,1 ul dH ₂ O et 140 ul de 2 M MES tampon pH 2,9 à l'échantillon PP.
3. Ajouter 57,5 ul d'une solution fraîchement préparée de N-éthyl-N '- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide solution mère (EDC) dissous dans dH ₂ O avec une concentration de 100 mg / ml à l'échantillon DF, ou une solution de 10 ul d'EDC l'échantillon PP. Vortex les échantillons pendant 1 minute.
4. Ajouter 16,9 pi de solution de HSA avec une concentration de 118 mg / ml à chaque échantillon.
5. Incuber les échantillons pendant 2 heures à température ambiante tout en agitant à 300 tours / min.
6. Dialyser le DF et les échantillons de PP 3 fois contre 2 litres de tampon phosphate salin (PBS) à pH 7,4 pendant plusieurs heures chacune. Effectuez toutes les étapes de dialyse à 4 ° C.
7. Centrifuger l'échantillon de 10 minutes à 14000 xg et recueillir les DF surnageant contenant ou PP conjugué à la HSA.
8. Vérifiez surnageant pour les protéines en effectuant une SDS-PAGE, utilisant des gels à 12%. Charge d'environ 12 mg de HSA conjugué dans un slot de gel.

2. Déterminer le taux de couplage de la drogue conjugués (figure 2)

1. Pour l'analyse du taux de couplage de DF et PP conjugués par HPSEC utiliser un 100 mM tampon phosphate de sodium pH 6,5 contenant 150 mM de NaCl et de l'azide de sodium à 0,05%. Utilisez un x 7,8 à 300 mm TSK-Gel-G2000 colonne _SWXL.
2. Effectuer la détection des signaux en utilisant une ligne couplée RI et le système de détecteur UV.
3. Préparer un échantillon standard HSA avec une concentration de 1 mg / ml dans dH ₂ O. Pour étalonnage du détecteur d'injecter 50 ul HSA solution standard.
4. Calculer la _RI RI k constante et _l'UV UV k constant pour le détecteur. Utilisez la zone de formules _RI = _RI k * [(dn / dc) _HSA * c (HSA)] et la zone _{UV UV} = k * [(DA / DC) _HSA * c (HSA)] avec (dn / dc) = _HSA 0,185 et (DA / DC) = 0.518 _HSA ^5.
5. Préparer DF et PP standards dérivés à des HPSEC que les montants de 5, 10 et 30 nmol de ces deux normes peuvent être facilement injectées.
6. Calculer les valeurs moyennes de (dn / dc) et de _{la drogue} (DA / DC) _{des médicaments} pour les deux normes. Pour DF, un (dn / dc) de 0,235 ± 0,010 et un (DA / DC) de 39,000 ± 0,493 a été déterminé. Pour PP, un (dn / dc) de 0,328 ± 0,016 et un de (DA / DC) ± 2,464 53,155 a été déterminée.
7. Injecter conjugués drogue sur HPSEC et de déterminer leur RI et UV domaines de pointe.
8. Calculer la concentration de DF, dérivé PP, et HSA en résolvant les équations deux zones _RI = _RI k * [(dn / dc) _{des médicaments} * c (médicament) + (dn / dc) _HSA * c (HSA)] _UV région et _UV = k * [(DA / DC) _{de drogue} * c (médicament) + (DA / DC) _HSA * c (HSA)] pour les inconnues.

3. BAT à l'aide de médicaments conjugués

1. Préparer sept coupes cytométrie de flux et de les étiqueter selon leur contenu: le contrôle sans tache, le contrôle négatif, contrôle positif, et conjugués de drogue.
2. Pipeter 50 pi de tampon de stimulation B-CCR-STB (Flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) dans les flacons réservés pour le contrôle sans tache et négatifs. Comme contrôle positif, utiliser 50 ul d'une solution anti-FceRI fournies par le kit Flow2 CAST. Ajouter la quantité appropriée de solution de conjugué à l'flacons réservés pour les conjugués de drogue en créant une série de dilution 1:10 de 0,02 -20 pg / ml DF et PP conjugué conjugué (concentrations finales dans un volume d'essai de 200 pi). Ces expériences de titration doit être réalisée pour déterminer la concentration d'activation des basophiles optimale pour chaque échantillon de patient.
3. Ajouter 100 ul de tampon de stimulation à chaque tube de sang EDTA et 50 patients ul du tout. Mélanger les échantillons soigneusement.
4. Pipeter 20 ul Flow2 réactif de révélation CAST contenant des anti-CCR3 anticorps marqués à la phycoérythrine (PE) et des anticorps anti-CD63 marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) à chaque tube et mélanger à nouveau. Ne pas pipeter réactif de révélation dans l'échantillon non coloré!
5. Incuber les échantillons pendant 45 minutes dans un bain d'eau à 37 ° C.
6. Arrêtez la réaction sur la glace pendant 5 minutes.
7. Lyse érythrocytes en ajoutant 2,0 ml de réactif CAST Flow2 lyse à chaque flacon et le vortex doucement. Incuber les échantillons dans l'obscurité pendant 10 minutes à température ambiante.
8. Centrifuger les échantillons pendant 5 minutes à 500 xg et le surnageant décanter avec précaution.
9. Resuspendre les cellules dans 500 ul de tampon de lavage Flow2 CAST et de stocker la glace jusqu'à la cytométrie de flux.
10. Ajustez la tension s le cytomètre en flux dearam è tres de diffusion vers l'avant et de côté (FSC, SSC) tout en acquérant de l'échantillon non colorées.
11. Porte des cellules prédit que les lymphocytes de la parcelle SSC-FSC à l'intrigue SSC-PE. Les basophiles sont identifiés par un PE-anticorps anti-CCR3 anticorps comme CCR3 ^{Salut lo} SSC et les porte dans l'intrigue FITC-PE. L'anticorps anti-CD63 détecter les basophiles activés est marqué au FITC.
12. Régler le seuil à maximum 2,5% de basophiles CD63 comme ^Salut dans le contrôle négatif. Un échantillon est considéré positif pour l'activation des basophiles, si basophiles> 5% sont CD63 ^salut et l'indice de fluorescence moyenne (IFM) de l'échantillon divisé par le MFI du contrôle négatif dépasse 2 (figure 3).

4. Les résultats représentatifs:

Cette expérience évalue BAT comme un outil bénéfique pour détecter hypersensibilité médicamenteuse IgE-dépendante. Conjugués de protéines d'AINS sont utilisés pour l'activation des basophiles. Par HPSEC avec RI et de l'état d'agrégation détection UV, le degré de couplage et de rendement effectif des conjugués sont déterminées. Comme la figure 4 montre, 43,5% des conjugués DF resté monomères avec un degré de couplage de 5,0 DF / HSA. Pour les agrégats un degré de couplage de 9,5 a été déterminée. Le conjugué propyphenazone a été démontré que des monomères constitués de 68,5% avec un degré de couplage de 21,2. Le degré de couplage des agrégats était de 27,9. Au total, le degré de couplage déterminée de conjugués DF DF était de 7,6 et que des conjugués PP était de 23,2.

BAT réalisé avec des conjugués dans des conditions optimisées (concentration des conjugués, le temps de stimulation) permis d'étudier les réactions IgE-dépendante dans l'hypersensibilité aux AINS. Comme le montre la figure 5, seul le PP a été conjugué à même de déclencher l'activation des basophiles visualisés par une régulation positive de l'expression en surface CD63: 20,6% des basophiles ont été activés caractérisée par un journal de changement dans l'intensité de fluorescence. L'IMF a augmenté par un facteur de 4,9 par 386 (témoin négatif) à 1893. En revanche, en utilisant le conjugué DF seulement 3,1% des basophiles ont été activés, qui était inférieur à 5% de coupure. Aussi l'IMF n'a augmenté que d'un facteur 1,1 (limite 2,0) à partir de 197 (témoin négatif) à 210. La validité de dosage est donnée par (i) <5% d'activation des basophiles dans le contrôle négatif, (ii) un journal de changement dans l'intensité de fluorescence d'une sous-population des basophiles, et (iii)> 50% basophiles activés (contrôle positif).

Figure 1. Couplage des dérivés DF et PP à la HSA. Après dissolution de la drogue, l'eau, tampon MES, et EDC (réactif de couplage) sont ajoutés. Les échantillons sont vortexés pendant 1 minute avant de HSA est pipeté aux solutions de drogue. Dans les 2 heures d'agitation à température ambiante, la drogue de façon covalente se lient à la SAH. Monomères ainsi que des agrégats peuvent en résulter.

Figure 2. Calcul des degrés d'accouplement. Tout d'abord, les constantes k _RI et _UV k sont déterminés. Par conséquent, HSA standard avec une concentration connue est injecté dans le système HPSEC. (Dn / dc) et (DA / DC) de HSA sont donné des valeurs de 0,185 et 0,518, respectivement ^5. Les domaines de pointe sont utilisées pour calculer les constantes. Deuxièmement, pour chaque médicament trois normes sont injectés afin de déterminer la drogue et de la concentration et les zones spécifiques du RI UV. Depuis _l'IR k et k constantes _UV sont connus à partir des étapes précédentes, les dérivés de médicaments spécifiques (dn / dc) et (DA / DC) peut être calculé. Troisièmement, la drogue-SAH conjugués sont injectés dans HPSEC. Les aires des pics obtenus sont utilisés pour calculer les concentrations de médicament et HSA par de pointe en résolvant les deux équations à deux inconnues.

Figure 3. Gating basophiles. Cellules prédit que les lymphocytes sont diffusion latérale fermée par rapport prodiffusion (SSC-FSC parcelle). Les basophiles sont identifiés comme CCR3 ^{Salut lo} CSE à partir des lymphocytes gated (SSC-CCR3-PE parcelle). Les basophiles sont analysés pour l'activation (CD63 ^Salut) dans la parcelle CD63-FITC-CCR3-PE. Le contrôle négatif est utilisé pour définir le seuil maximal des basophiles 2,5% restants CD63 ^Salut.

Figure 4. Degrés de couplage Déterminé des conjugués drogue. Du RI et les signaux UV montrent deux pics représentant les agrégats (élution à volume faible rétention) et les monomères (élution à un volume élevé de rétention) des médicaments-SAH conjugués. Les pourcentages de monomères et d'agrégats (déterminé à partir des signaux IR) et de leurs degrés de couplage sont représentés (n = 1).

Figure 5. Basophiles Activatile test. Résultats de la drogue conjugué activé échantillons, les contrôles négatifs, et les contrôles positifs sont indiqués dans le CD63-FITC-CCR3-PE parcelles (n = 1).

Discussion

BAT est un bien établis mais pas encore la méthode couramment utilisée pour le diagnostic des IgE maladies allergiques ^6,7. Pour hypersensibilité médicamenteuse, toutefois, son application est compromise tant que composés de faible poids moléculaire ne sont pas capables de réticuler récepteurs IgE, une condition préalable à l'activation des basophiles ^8. Par conséquent, les médicaments sous enquête doivent être couplés de manière covalente à des protéines porteuses appropriées (par exemple, HSA). Surtout, le degré de couplage (ie le nombre de molécules de médicament par protéine porteuse) doit être contrôlée afin de garantir l'activité immunologique (ie IgE récepteurs de réticulation) de conjugués. Théoriquement, deux haptènes par molécule porteuse doit être suffisante pour le récepteur d'IgE de réticulation et aussi peu que cinq molécules DF par HSA a été démontré pour déclencher la libération du médiateur dans un test basé sur des cellules ^4. Les deux conjugués, PP-HSA et HSA-DF, ont été déterminés à afficher un degré de couplage suffisamment élevée (HPSEC) et d'être immunologiquement actives rendant réactifs appropriés pour l'utilisation des MTD. Une autre question peut être que les métabolites de médicaments peuvent jouer un rôle, comme un métabolite plutôt que de la molécule mère peut provoquer la réaction d'hypersensibilité. En cas de DF, cette possibilité a été préalablement évalué en détail l'aide de cinq Phase I majeurs métabolites et une variante de liaison ^4. Les facteurs importants pour la maîtrise de la technique décrite notamment la qualité de l'échantillon de sang (<12 heures depuis la collecte de sang, le nombre de basophiles détectée> 500) et l'optimisation des conditions de stimulation (temps, dose). En outre, les soi-disant non-répondeurs qui n'ont même pas réagir avec le contrôle positif (anticorps dirigé contre le récepteur des IgE) doivent être identifiés. Par conséquent, les critères de validation ont d'inclure un anticorps anti-FceRI comme témoin positif. Un avantage important de l'utilisation de conjugués drogue est le fait qu'elles apparaissent non toxique, contrairement aux médicaments purs, comme le montre pour DF-HSA conjugué par la co-stimulation avec des anticorps anti-FceRI BAT ^4. Pur DF, en revanche, affiche des effets cytotoxiques à une concentration de 1,25 mg / ml causant des problèmes avec l'interprétabilité des MTD ^9. Généralement, les tests de cytotoxicité potentielle est fortement recommandé pour tous les médicaments nouvellement produites conjugué.

Ici, nous avons montré le potentiel de la PP-HSA conjugué utilisé dans les MTD pour révéler une hypersensibilité médiée par les IgE. En revanche, DF hypersensibilité n'est pas associé avec les IgE démontrée par l'absence d'activation des basophiles en réponse à DF-HSA conjugué. Surtout, en cas d'incertitude concernant un mécanisme IgE-médiée, conjugués doivent être évaluées pour l'activité immunologique par des systèmes de test in vitro de cellules à base comme cela a été montré pour DF ^4.

Utilisation de la configuration décrite de conjuguer médicaments à bas poids moléculaire covalente à la protéine porteuse appropriée molécules d'un certain nombre de réactions d'hypersensibilité, y compris contre les drogues antibiotiques, d'autres AINS, contraste radiologique des médias, des relaxants musculaires, des anesthésiques, etc peuvent être étudiés pour une participation d'une IgE mécanisme. Par conséquent, les MTD peuvent servir comme un complément aux méthodes existantes de diagnostic (test cutané, des tests de provocation orale).

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif / appareil	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
2 - (N-morpholino) éthanesulfonique	Sigma	M3671	-
7,8 x 300 mm gel TSK -G2000SWXL colonne	Bioscience Tosoh	08540	-
BD FACSCanto II	Becton Dickinson	338962	-
Centrifugeuse de paillasse	Sigma	-	-
Sel de sodium de diclofénac	Sigma	D6899	-
EDTA Vacutainer	Becton Dickinson	368589	-
Flow2 Kit CAST	Laboratoires Bühlmann	FK-CCR	Efficace kit CAST Juin 14, 2011 Flow2 est maintenant un sort de débit
HP1100 système HPLC	Hewlett Packard	-	-
Albumine sérique humaine	Sigma	A9511	-
Centrifugeuse de laboratoire	Eppendorf	-	-
N-éthyl-N'-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC)	Sigma	E6383	-
Comprimés PBS	AppliChem	A9199	-
Dérivés propyphenazone	Département de Biologie Moléculaire, Université de Salzbourg, Autriche	-	-
Shaker	Eppendorf	-	-
L'azide de sodium	Sigma	S8032	-
Le chlorure de sodium (NaCl)	Sigma	S1679	-
Carbonate acide de sodium	Sigma	90421C	-
Sodium hydroxyde	Sigma	S5881	-
Le phosphate de sodium	Sigma	342483	-
Matrice de détecteurs Triple	Viscotek	TDA302	-
BioVortex personnels V-1 plus	Peqlab	90-V-1	-
1012 Bain-marie	GFL	1012	-