הרחבת לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מדם טבורים שציטומגלווירוס יעד, וירוס אפשטיין באר, וadenovirus

Summary

כאן אנו מתארים אימון הראשון הטוב הייצור (GMP)-תואמת שיטה של ​​ייצור תאי T ציטוטוקסיים וירוס ספציפיים (CTL) מדם טבורים, מקור לתאי T בעיקר נאיביים.

Abstract

הידבקות בוירוסים לאחר השתלת תאי גזע הן בין הגורמים השכיחים ביותר למוות, במיוחד לאחר דם טבורים (CB) השתלה (CBT) בי CB אינו מכיל מספרים ניכרים של תאי וירוס מנוסים T שיכול להגן על הנמען מהזיהום ^{1. - 4} אנחנו ואחרים הראינו שנוצרו וירוס הספציפי CTL מתורמים נושאים את ה HIV והחדירו לנמען הם בטוחים ומגוננים. ^5-8 עם זאת, עד לאחרונה, תאי T ספציפיים לוירוס לא יכולים להיות שנוצרו מדם הטבורי, כנראה עקב היעדר תאי T זיכרון ספציפיים לוירוס.

במאמץ טוב יותר כדי לחקות את התנאים בייזום vivo של תאי T נאיביים, הקים שיטה שהשתמשה בתאים דנדריטיים CB-derived (DC) transduced עם וקטור adenoviral (Ad5f35pp65) המכיל את האנטיגן pp65 immunodominant CMV, ולכן נוהג סגולי תא T לקראת CMV ואדנווירוס. ⁹ בייזום, אנו משתמשים ma אלהDCS tured כמו גם תאי T CB-derived בנוכחותם של ציטוקינים IL-7, IL-12, ו IL-15. ¹⁰ בגירוי השני שהשתמשנו EBV הפך-תאי B, או EBV-LCL, שמביעים שניהם אנטיגנים EBV ממוסס סמוי ו. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL משמש כדי לגרות את תאי T בנוכחות של IL-15 בגירוי השני. גירויים שלאחר מכן להשתמש Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL וIL-2.

מ50x10 ⁶ תאי mononuclear CB אנו מסוגלים לייצר למעלה מ 150 10 ⁶ תאי T x וירוס ספציפיים שlyse מטרות אנטיגן פעמו וציטוקינים שחרור בתגובה לגירוי antigenic. ¹¹ תאים אלו יוצרו באופן GMP תואם רק באמצעות חלק 20% מיחידת דם טבורים מופרדת ותורגם לשימוש קליני.

Protocol

1. בידוד התא mononuclear (יום 0)

1. הכנס ספייק של מתאם luer נקבה לתוך פתח יציאה מחלק 20% מיחידת דם הטבורים, לצרף מזרק ולהסיר דם. העברת דם מופשר עד 20 מ"ל של RPMI חמם בצינור צנטריפוגה מ"ל 50. יש לשטוף את שקית דם טבורים עם 5 מ"ל של RPMI ולהעביר לאותו הצינור צנטריפוגה.
2. צנטריפוגה תאים במשך 10 דקות ב 400 x גרם. לשאוב supernatant.
3. Resuspend תאים ב20 מ"ל של RPMI החם. תאי שכבה על גבי 15 מ"ל של Lymphoprep בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. צנטריפוגה 40 דקות @ 400 x גרמו.
4. לקצור את הממשק המכיל את תאי mononuclear ולשטוף ב20 מ"ל של RPMI. צנטריפוגה במשך 10 דקות @ 450 x גרמו.
5. לשאוב supernatant ולשטוף ב20 מ"ל של RPMI. ספירת תאים ולסובב במשך 5 דקות @ 400 x גרמו.
6. לשאוב תאי supernatant ו resuspend ב 5 X 10 ⁶ תאים / מ"ל של בירת Cellgenix תקשורת (סרום חינם) mononuclear. הסר 1 מ"ל לדור EBV-LCL והכניס 15 המ"ל centrifuge צינור.

2. דור תאים דנדריטים (החל ביום 0)

1. 2 מיליליטר הצלחת של תאים (כבר בשעת 5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל של DC תקשורת) לגם לתוך צלחת 6-כן. השאר באינקובטור במשך 1-2 שעות.
2. לאחר 1-2 שעות, לשטוף את התאים שאינם חסידים על ידי שטיפת 3-4 פעמים עם PBS. לאסוף את התאים שאינם חסידים והקפאה. הוסף 2 מ"ל / היטב של תקשורת DC המכילה 1000 U / מ"ל ​​של IL-4 ו 800 U / mL GM-CSF.
3. 3-4 ימים לאחר DC ייזום, לחדש IL-4 ו-GM-CSF על ידי הוספת 100 μL / גם של תקשורת המכילה ריכוז סופי של 1000U/mL IL-4 ו 800 U / mL GM-CSF.
4. ביום 5-6, הקציר DC על ידי גירוד היטב עם פיפטה העברה. ספירת התאים וצנטריפוגות הגדולים במשך 5 דקות @ 400 x גרם. Aspirate התקשורת וResuspend DC ב2x10 ⁶ תאים / מ"ל של DC תקשורת. הוסף 0.5 מ"ל / היטב של צלחת 24 היטב.
5. Transduce DC באמצעות Ad5f35pp65 הווקטור במשרד פנים לכל תא של 10 יחידות זיהומיות. הוסף vector לכל אחד גם בצלחת 24 היטב. דגירת תאים עבור 1.5 שעות. לאחר 1.5 שעות, להוסיף 1.5 מ"ל / היטב של DC מדיה מכיל: 1000 U / mL IL-4, 800 U / mL GM-CSF, 10 ng / mL TNF-אלפא, מיקרוגרם 1 / המ"ל PGE-1, 100 ng / mL IL-6, ו 10 ng / mL IL-1beta. ציטוקינים אלו יבשילו את DCS.

3. דור של EBV-LCL (החל ביום 0)

1. צנטריפוגה שפופרת המכילה את 5 x 10 ⁶ תאי mononuclear. הוסף 200 μL של EBV המרוכז B95.8 supernatant ו -1.8 מ"ל של מדיה מלאה (RPMI + 10% FBS + 2 מ"מ L-גלוטמין) ציקלוספורין המכיל (מיקרוגרם 1 / מ"ל).
2. 100 μL aliquot של תאים לתוך 10 בארות של צלחת 96 היטב ו200 μL לתוך 5 בארות. הוסף 100 μL של מדיה המלאה + ציקלוספורין לבארות המכילות רק 100 μL של תאים. מלא בארות שנותרו עם מים סטריליים.
3. להאכיל LCL השבועי ולהרחיב מצלחת 96-היטב לצלחת 24 גם לאחר ~ 2 שבועות. אחרי שבוע נוסף, להעביר לבקבוק וT25 בהעברת השבוע לאחרT75 בקבוק. בשלב זה לא מומלץ להקפיא aliquots של LCL. זה בדרך כלל לוקח חודש 1 כדי לייצר כמות מספקת של LCL.

4. CTL ייזום - 7 ימים לאחר תחילת DCS

1. DCS הקציר ולהקרין בקצב של 30 Gy. שטוף 4 X וספירה. Resuspend DC בתקשורת סלולרית T המכיל סרום אדם (45% RPMI, לחץ עליה של 45%, 10% נסיוב אדם, 2 מ"מ L-גלוטמין) @ 1 x 10 ⁵ DCS / מ"ל.
2. הפשר תאים שאינם חסידים מצעד 2.2. שטוף תאים, ולספור. Resuspend ב 2 x 10 ⁶ תאים שאינם חסידים / מ"ל בתקשורת סלולרית T המכיל סרום אנושי. הוסף 10 ng / mL IL-7 ו-IL-12, ו 5 ng / mL IL-15. הוסף 1 מ"ל של תאים לטובים בצלחת 24 היטב. הוסף 1 מ"ל של בירה לטובה. מלא בארות ריקות של צלחת 24 היטב עם מים סטריליים.
3. 7 ימים לאחר תחילת תא T, הזנה ו / או לפצל את התאים עם תקשורת סלולרית T המכיל סרום אנושי.
4. 9-12 ימים לאחר תחילת תא T, להקפיא את תאי T עד LCL מוכן.
5. ONCE LCL הרחיב וpassaged בT75 צלוחיות, transduce LCL ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות @ 400 x גרמו. הוסף את הווקטור לתא הגלול במשרד פנים של 100 יחידות זיהומיות לכל תא. דגירה במשך 1.5 שעות. לאחר 1.5 שעות, resuspend בתקשורת מלאה ב5 X 10 ⁵ LCL / מ"ל ולהוסיף 2 מ"ל לכל גם בצלחת 24 גם ^12.
6. לאחר 2 ימים, לקצור LCL ולהקרין ב40 Gy. שטוף 4 X וספירה. Resuspend LCL בתקשורת סלולרית T המכיל סרום אדם ב 2.5 10 ⁵ תאים / מ"ל x. הוסף 1 מ"ל של LCL להיטב של צלחת 24 היטב. כמו כן, הוסף 5 X 10 ⁶ LCL למכשיר Grex40 תרבות, כמו גם 5 ng / mL IL-15 ^13.
7. לקצור את תאי T. צנטריפוגה במשך 5 דקות @ 400 XG, לשאוב supernatant, resuspend ובתקשורת סלולרית T המכיל סרום אנושי ב1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל T. הוסף 5 ng / mL IL-15 ולהוסיף 1 מ"ל / היטב של תאי T (סך של 1 10 x ⁶ תאי T) לLCL שכבר נמצאים בצלחת 24 היטב. בGrex40, יביאהנפח הכולל של תקשורת עד 30 מ"ל.
8. בפוסט גירוי 3-4 ימים, אז אם התאים הם confluent לפצל אותם (בצלחת) 1:1 ולהוסיף תקשורת טריה המכילה 50 U / mL IL-2. אם הם לא מתלכדים אז פשוט לשאוב ½ התקשורת ולהחליף עם מדיה המכילה 50 U / mL IL-2. בGrex40, לשאוב חצי מהתקשורת, להחליף עם תקשורת טריה, ולהוסיף 50 U / mL IL-2.
9. ביום 7, חוזר כמו בשלב 4.6 אלא להשתמש IL-2 ביום הגירוי, לא IL-15.

5. נציג תוצאות

סכמטי של פרוטוקול ה-FDA ייצור GMP התואם מתואר באיור 1. התהליך לוקח כ 50 ימים. שיטות אופייניות של יצירת תאי T ספציפיים לוירוס להרחיב תאי T זיכרון קיים, עם זאת, חסרי דם טבורים ותאי T-וירוס מנוסה ולכן אנחנו צריכים vivo ממשלה הנאיבית T תאים לשעבר. לשם כך, אנו משתמשים בתאים דנדריטיים, כמו גם את הציטוקינים IL-7, IL-12, ו-IL-15,הכרחי ליצירה סגולית נגיפית.

לאחר 3 גירויים, התשואה צריכה להיות מעל 100x10 ⁶ תאים. אם תאים מספיקים אינם זמינים, גירויים נוספים יכולים להתבצע עד המספר הרצוי של CTLs זמין. רוב התאים אלה צריכים להיות CD3 + עם תערובת של CD4 + ותאי T CD8 +. לא צריך להיות פחות מ 15% תאי NK (CD3-/CD56 +) ופחות מ 1% CD19 + B תאים (איור 2).

CTL המורחב צריך להכיר את האנטיגן pp65 מCMV, hexon ופנטון מאדנווירוס, כמו גם אנטיגנים EBV רבים שבאים לידי ביטוי בEBV-LCL. כאשר נבדק בבדיקת ELISPOT, CTL צריך להפריש יותר IFN-? בתגובה לאנטיגנים אלה מאשר אנטיגנים רלוונטיים (איור 3).

CTL צריך גם lyse מטרות נגיפיות פפטיד פעם תקיעות PHA כאלה. בassay Cr ⁵¹ שחרור, CTL צריך lyse LCL, CMVpp65 פעם וadenovirus hexon ו /או מטרות פנטון פעם אבל לא פעם יעדים עם פפטידים רלוונטיים (איור 4).

איור 1. דור של CTL רב וירוס ספציפי מדם הטבורי. סכמטי המציג את כל התהליך של ייצור CTL מדם הטבורי. ראשית את תאי דם טבורי mononuclear מבודדים מחלק 20% מיחידת דם הטבורים המופרדות. למעט 5x10 ⁶ תאים הנשמרים לדור LCL, כל התאים אז מצופים בתקשורת סלולרית הדנדריטים במשך 1-2 שעות, ובשלב הזה התאים שאינם חסידים נקצרים וקפוא. DC אז האכיל DC מדיה המכילה IL-4 ו-GM-CSF. לאחר 5 ימים של התרבות, DC הם התבגרו וtransduced עם וקטור adenoviral המכיל את האנטיגן pp65 immunodominant CMV. בייזום, DC אלה בשילוב עם התאים שאינם חסידים כמו גם ציטוקינים IL-7, IL-12,ו IL-15. בגירויים שלאחר מכן, באותו הווקטור adenoviral משמש לtransduce EBV-LCL, המשמשים כתאי מציגי אנטיגן. IL-15 משמשים בגירוי השני וIL-2 לאחר מכן.

איור 2. הפנוטיפ של כתוצאה מתאי T. הראה הוא אחוז תאי חיים הנכללים בשער הלימפוציטים. CTL הוא CD3 + וסוג CD4 + או CD8 + אבל בעיקר CD3-/CD56- וCD19-.

איור 3. פונקציונלי תא T. תא T ספציפי נבדק על ידי IFN-γELISPOT. תאי T שפעמו עם פפטידים חופפים פורשים כל החלבון של hexon, פנטון, pp65, ואנטיגן הרלוונטי IE-1. CTL לבד מציין תקשורת בלבד. Autologous LCL היה מוקרן והוסיף ב1x10 ⁵ / כן. שמוצג הוא המקום המרושע להרכיב התא גount בארות שלושה עותקים.

איור 4. פעילות Cytolytic של CTL. היכולת של CTL כתוצאה lyse למטרות מבטאות אנטיגנים נגיפיים נבדקה בבדיקת ⁵¹ Cr. תקיעות ⁵¹ Cr הכותרת-PHA עצמיות היו פעמה עם פפטידים חופפים פורשים כל אנטיגן או ⁵¹ Cr-השתלת LCL הכותרת היה cocultured עם CTL. לאחר 4 שעות, שחרור גמא נספר על דלפק גמא.

Discussion

אסטרטגיות נוכחיות נועדו לשלוט זיהומים נגיפיים לאחר CBT יכולות להיות יעילות, אבל הם קשורים עם רעילויות משמעותיות, הם יקרים, ואינם מעניקות הגנה לטווח ארוכה מפני זיהום מאוחר יותר. למעשה, השימוש בכמה תרופות אנטי עלול להגביל את ההתפשטות של תאים ספציפיים לוירוס T שאחרת ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגים
RPMI 1640	Invitrogen	21870-076
DC תקשורת	CellGenix	20801-0500
EHAA (הבינוני של לחץ)	אירווין מדעי	9195
סרום אדם	ג'מיני מוצרים ביו	100-110
חדירות Cultureware 18	וילסון-וולף	80040S
IL-2	כירון (TCH רוקחות)
IL-12	NCI / CTEP
IL-15	CellGenix	1013-050
IL-7	מו"פ	AFL207
IL-1beta	מו"פ	AFL201
IL-6	תאGenix	1004-050
GM-CSF	TCH מרקחת
IL-4	מו"פ	AFL204
TNF-אלפא	מו"פ	AFL210
Ad5f35pp65	מתקן ייצור וקטור CAGT BCM
העברת פלזמה מוגדרת עם מתאם luer נשי	אמנה רפואית	89-550-66j
Lymphoprep	Nycomed	1114550